奧曲肽對胰腺癌模型大鼠細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制研究

楊梅,柳英輝,陳文習(xí)

胰腺癌是一種臨床較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度極高，直接導(dǎo)致臨床診斷和治療均較為困難[1-2]。胰腺癌癥狀主要臨床表現(xiàn)為腹痛、乏力、黃疸以及一系列的消化道癥狀，對患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重的影響，因此尋找一種安全有效的治療方法具有重要意義[3]。奧曲肽能夠調(diào)控胰腺分泌，臨床常應(yīng)用于胰腺炎的治療，但是關(guān)于其對胰腺癌癥狀干預(yù)效果的研究還相對較少。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)[4]，本文研究中設(shè)計實(shí)驗(yàn)，建立胰腺癌大鼠模型，并使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)，旨在探究奧曲肽對胰腺癌模型大鼠細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究動物 選取50只SD健康雄性大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，年齡3～5個月，平均年齡(4.1±0.5)月，體質(zhì)量200～252 g，平均體質(zhì)量(225.3±10.6)g。所有大鼠均養(yǎng)殖在干凈籠子里，室溫控制在20.3～23.9 ℃，相對濕度35%～40%，每天光照12 h，喂飲純凈水，飼養(yǎng)時間為1周。本文研究所做實(shí)驗(yàn)均獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 奧曲肽(北京諾華制藥有限公司)；大鼠抗小鼠Bcl-2抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠PI3K抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗兔Akt抗體(Sigma公司)；兔抗大鼠IL-6、TNF-α抗體(Dako公司)；PBS緩沖液、SDS-PAGE蛋白緩沖液、TBST緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組 使用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠作為本文研究正常組，不做任何處理，其余40只大鼠進(jìn)行胰腺癌模型建立，建模方法參照王云檢[5]研究中建模標(biāo)準(zhǔn)并作出適當(dāng)改動：建模前1 d對所有大鼠禁食不禁水。對大鼠進(jìn)行麻醉處理后于上腹部正中部位作一1 cm左右切口，使胰腺組織暴露出來，在胰腺組織尾部將胰腺組織被膜以及部分實(shí)質(zhì)切開1 mm左右，將9 mg DMBA植入，之后將切口縫合，并進(jìn)行預(yù)防感染處理。1周后對造模大鼠進(jìn)行觀察，大鼠皮下出現(xiàn)直徑0.8 cm左右的結(jié)節(jié)視為建模成功，最終建模成功37只，將37只胰腺癌大鼠隨機(jī)分為模型組10只以及低、中、高劑量奧曲肽組各9只。分別使用0.2 mg、0.4 mg、0.6 mg奧曲肽對低、中、高劑量奧曲肽組大鼠進(jìn)行皮下注射，1次/d，連續(xù)給藥10周，正常組與模型組大鼠均使用生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 標(biāo)本采集 停止用藥后，對五組大鼠進(jìn)行全麻處理，采用斷頭法處死，將大鼠胰腺組織完全剝離出來，并對胰腺癌組織體積、質(zhì)量進(jìn)行檢測，然后進(jìn)行病理組織切片。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞凋亡率、周期分布檢測 使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、周期分布情況，將細(xì)胞傳代至5孔板之中，并將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，加入0.25%胰蛋白酶消化，使用2 000 r/min的離心機(jī)處理5 min后使用PBS緩沖液清洗2次，再次離心處理并收取細(xì)胞，加入1 mL PI染液，在避光的常溫環(huán)境中放置1 h，然后用特異熒光標(biāo)記后，在鞘液包裹下高速流動中，流動期間會發(fā)射出光子，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期分布情況。

1.2.4 HE染色處理 對五組大鼠切片樣本進(jìn)行染色處理，使用二甲苯進(jìn)行常規(guī)脫蠟處理2次，每次5 min，然后在梯度酒精下水花處理3 min，自來水沖洗1次；使用蘇木素染色5 min，自來水沖洗1次；使用濃度為1%的鹽酸酒精分化處理30 s，在0.2%氨水中反藍(lán)處理2 min，自來水沖洗1次；在濃度0.5%伊紅染色10 min，自來水沖洗1次；使用乙醇梯度進(jìn)行脫水處理，最后用中性樹膠進(jìn)行封片，使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 Western blot法檢測Bcl-2、PI3K、Akt、PTEN、p-Akt、mTOR表達(dá) 使用PBS緩沖液清洗標(biāo)本3次，分離緩沖液之后裂解0.5 h，對蛋白濃度進(jìn)行測定。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液后電泳10 min，在10%的牛奶中浸泡電轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫封閉1.5 h；與一抗結(jié)合之后使用TBST進(jìn)行稀釋，并孵育、保存；次日使用TBST液進(jìn)行清洗，與二抗結(jié)合后常溫孵育1 h，再次清洗，加入顯影劑顯色，對Bcl-2、PI3K、Akt、PTEN、p-Akt、mTOR表達(dá)進(jìn)行測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺組織病理組織學(xué)觀察

如圖1所示，正常組大鼠胰腺組織正常，模型組大鼠胰腺組織出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，細(xì)胞排列不規(guī)則，低、中、高劑量奧曲肽組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象出現(xiàn)減輕，高劑量奧曲肽組大鼠僅有輕微的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象，胰腺組織基本正常。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理組織學(xué)觀察圖(HE染色，×200)

2.2 各組大鼠腫瘤體積、質(zhì)量比較

如表1所示，模型組大鼠腫瘤體積、質(zhì)量均高于低、中、高劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高劑量奧曲肽組大鼠腫瘤體積、質(zhì)量均低于低、中劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 各組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡、周期分布情況對比

如表2所示，模型組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率低于其他三組，且高劑量奧曲肽組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率高于低、中劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高劑量奧曲肽組處于G1期的細(xì)胞比例高于模型組，處于S期與G2期的細(xì)胞比例低于模型組，且高劑量奧曲肽組處于G1期的細(xì)胞比例高于低、中劑量奧曲肽組，處于S期與G2期的細(xì)胞比例低于低、中劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠腫瘤體積、質(zhì)量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量奧曲肽組比較，△P<0.05；與中劑量奧曲肽組比較，☆P<0.05

2.4 各組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表達(dá)情況對比

如表3、圖2所示，正常組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相對表達(dá)量均低于其他四組，模型組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相對表達(dá)量均高于低、中、高劑量奧曲肽組，且高劑量奧曲肽組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt相對表達(dá)量均低于低、中劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡、周期分布情況對比

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量奧曲肽組比較，△P<0.05；與中劑量奧曲肽組比較，☆P<0.05

表3 各組大鼠細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt表達(dá)水平對比

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量奧曲肽組比較，△P<0.05；與中劑量奧曲肽組比較，☆P<0.05

圖2 Bcl-2、PI3K、Akt表達(dá)WB圖

2.5 各組大鼠細(xì)胞周期蛋白PTEN、p-Akt、mTOR表達(dá)情況對比

如表4、圖3所示，正常組大鼠細(xì)胞周期蛋白PTEN相對表達(dá)量高于其他四組，p-Akt、mTOR相對表達(dá)量低于其他四組；模型組大鼠細(xì)胞周期蛋白PTEN相對表達(dá)量低于低、中、高劑量奧曲肽組，p-Akt、mTOR相對表達(dá)量高于低、中、高劑量奧曲肽組，且高劑量奧曲肽組大鼠細(xì)胞周期蛋白PTEN相對表達(dá)量高于低、中劑量奧曲肽組，p-Akt、mTOR相對表達(dá)量低于低、中劑量奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

胰腺癌是一種臨床較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，相比其他惡性腫瘤，胰腺癌惡性程度更高，因此又被稱為“癌癥之王”[6]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，近年來我國胰腺癌癥狀發(fā)病率不斷提升，并且發(fā)病早期無明顯癥狀，因此早期診斷率相對較低，病死率較高，對患者的身體健康甚至生命安全造成嚴(yán)重威脅[7-8]，但是目前臨床醫(yī)學(xué)對胰腺癌癥狀的發(fā)病機(jī)理尚未研究透徹，病因的不確定性加上其惡性程度高、多轉(zhuǎn)發(fā)、腫瘤耐藥等諸多原因，也導(dǎo)致臨床上對胰腺癌的治療一直是一個難題[9-10]。因此，尋找一種安全有效的治療胰腺癌的方法具有重要意義。

奧曲肽是一種廣譜的生長抑素的八肽衍生物，具有較多的生物活性，并且作用時間較長[11]。大量臨床研究表明，奧曲肽能夠調(diào)控胰腺分泌，因此奧曲肽常應(yīng)用于胰腺炎的臨床治療[12]，但是，關(guān)于奧曲肽對胰腺癌癥狀干預(yù)效果的研究還相對較少，因此，本文研究設(shè)計實(shí)驗(yàn)，建立胰腺癌大鼠模型，并使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)之后，胰腺癌模型大鼠腫瘤體積、重量出現(xiàn)下降，且奧曲肽劑量越大，腫瘤體積、重量下降幅度越明顯，說明奧曲肽能夠抑制胰腺癌組織生長，且具有一定的劑量依賴性。

表4 各組大鼠細(xì)胞周期蛋白PTEN、p-Akt、mTOR表達(dá)水平對比

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量奧曲肽組比較，△P<0.05；與中劑量奧曲肽組比較，☆P<0.05

圖3 PTEN、p-Akt、mTOR表達(dá)WB圖

本文研究中對胰腺癌模型大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)后，大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)上升，說明胰腺癌細(xì)胞凋亡速度加快，可能是因?yàn)閵W曲肽對細(xì)胞凋亡相關(guān)通路進(jìn)行干預(yù)，從而起到誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用。有學(xué)者在研究中表示，PI3K/Akt/Bcl-2通路蛋白的表達(dá)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]。Bcl-2是在線粒體通路中起著調(diào)節(jié)作用的一種重要基因，也是細(xì)胞的抑制與凋亡過程中比較重要的基因，當(dāng)Bcl-2的表達(dá)水平下降時，與其相關(guān)的Bax表達(dá)水平便會隨之升高，能夠起到促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡的作用，許多抗腫瘤藥物就是通過對Bcl-2表達(dá)進(jìn)行抑制來達(dá)到治療目的[14]。PI3K是一種磷脂酰肌醇3激酶，能在機(jī)體生長因子的作用下集成細(xì)胞膜[15]。Akt是在處于PI3K下游的靶蛋白，將它激活后，即激活其他靶蛋白，能促使細(xì)胞生長，具有抗凋亡的作用[16]。本文研究中對PI3K/Akt/Bcl-2通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，相比正常大鼠，胰腺癌模型大鼠Bcl-2、PI3K、Akt相對表達(dá)量較高，使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)后，Bcl-2、PI3K、Akt相對表達(dá)量受到調(diào)控而出現(xiàn)明顯的下調(diào)，說明奧曲肽可能是通過調(diào)控PI3K/Akt/Bcl-2通路相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)胰腺癌大鼠癌組織細(xì)胞凋亡的作用。

本文研究中還對胰腺癌模型大鼠腫瘤細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)后，胰腺癌模型大鼠腫瘤細(xì)胞周期分布情況受到明顯的調(diào)控，出現(xiàn)這一情況的原因可能是奧曲肽調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)通路，進(jìn)而改善胰腺癌細(xì)胞周期。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，PTEN、p-Akt、mTOR的表達(dá)與細(xì)胞周期分布情況密切相關(guān)[17-19]。徐萍[20]等在研究中表示，使用藥物對胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)控周期相關(guān)蛋白PTEN、p-Akt、mTOR的表達(dá)，進(jìn)而改善胰腺癌細(xì)胞周期分布。本文研究結(jié)果顯示，使用奧曲肽進(jìn)行干預(yù)后，胰腺癌模型大鼠PTEN表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，p-Akt、mTOR表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，說明奧曲肽能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PTEN、p-Akt、mTOR的表達(dá)，從而改善胰腺癌大鼠腫瘤細(xì)胞周期分布情況，起到阻滯細(xì)胞周期的作用。

綜上所述，使用較高劑量奧曲肽對胰腺癌模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠使大鼠腫瘤體積、重量下降，調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、PI3K、Akt的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，為胰腺癌的治療提供理論幫助。