酒精性肝硬化患者維生素D受體多態(tài)性與病理分期、肝功能的關(guān)系

陳城曲,熊利芬,李蜀豫

酒精性肝病是因長期攝入大量酒精所致的肝臟病變，其終末階段為酒精性肝硬化[1]。研究表明酒精性肝硬化死亡率非常高，且發(fā)病機制非常復(fù)雜，尚未徹底明確，可能與細(xì)胞凋亡、氧應(yīng)激、細(xì)胞因子、免疫介導(dǎo)等因素相關(guān)，未來需進一步證實[2-3]。該病尚無特效藥物進行治療，盡早診斷病情對改善預(yù)后而言至關(guān)重要，有利于緩解病情，使代償期延長[4-5]。近年來，有研究指出維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)多態(tài)性對肝臟疾病的評估具有一定作用，VDR是一種親核蛋白，它能結(jié)合于維生素D活性代謝產(chǎn)物，并對其生物學(xué)效應(yīng)進行介導(dǎo)[6-7]。本次研究納入150例酒精性肝硬化患者為研究對象，分析這類患者維生素D受體多態(tài)性與病理進展、肝功能的關(guān)系，目的在于進一步了解酒精性肝硬化患者的病理進展特征，為臨床治療提供依據(jù)，改善預(yù)后，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

酒精性肝硬化：參考中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組[8]制定的《酒精性肝病診療指南(2010年修訂版)》進行診斷：①臨床癥狀為食欲減退、乏力、體重下降、鼻出血、牙齦出血、腹痛、營養(yǎng)差、肝掌等；②血常規(guī)檢查提示白細(xì)胞計數(shù)下降、血小板水平下降；③病原學(xué)檢查提示HDV-M/HCV-M/HBV-M呈陰性；④經(jīng)彩超檢查提示肝細(xì)胞破壞、肝包膜厚度增加、纖維組織增生、回聲增強；⑤CT檢查提示肝臟密度下降，伴有脾大、肝門變寬表現(xiàn)；⑥長期飲酒史，規(guī)律飲酒史≥15年，男性>40 g/d，女性>20 g/d。

1.2 一般資料

納入我院2015年2月至2018年2月收治的酒精性肝硬化患者150例，采取回顧性分析，其中男102例，女48例，年齡42～76歲，平均(56.92±10.37)歲；病程2～8年，平均(5.42±1.69)年；Child-Pugh分級A級38例、B級58例、C級54例；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平(47.53±12.75)U/L；血清總膽紅素水平(15.34±7.42)μmol/L。研究方案經(jīng)本院倫理委員會通過。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述提及的酒精性肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷明確；②既往無自身免疫性肝病病史；③既往無藥物性肝損傷、嗜肝病毒等病史；④病歷資料完整；⑤入院前3個月內(nèi)無抗肝硬化治療史；⑥知情同意。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①因肝炎、藥物、毒物等其他原因?qū)е碌母斡不?；②合并惡性腫瘤；③既往有精神病史、語言障礙史，無法配合研究；④除肝臟外，還合并心、肺、腦等重要臟器損害。

1.4 方法

1.4.1 檢測方法 ①儀器：高速離心機、凝膠電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫水浴箱、擴增儀、超凈工作臺。②試劑：PCR擴增試劑、無水乙醇、雙蒸水、電泳級瓊脂糖、淋巴細(xì)胞分離液、氯仿。③檢測過程：所有患者均于入院當(dāng)日采集2 ml空腹靜脈血，置于抗凝管內(nèi)抗凝，經(jīng)離心處理后，將淋巴細(xì)胞分離，凍存?zhèn)溆?，提取DNA。PCT引物序列：上游引物：5’-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA-3’；下游引物：5’-TGGCGGCAGCGGATGTACGTCTGC-3’。PCR反應(yīng)條件：(94 ℃ 5 min、94℃ 30s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35個循環(huán))，72 ℃ 5 min。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)對VDR基因型進行判斷。BB型：缺乏相應(yīng)酶切位點，825 bp；bb型：存在相應(yīng)酶切位點，650 bp、175 bp；Bb型：雜合子，650 bp、175 bp、825 bp。同時進行肝組織病理學(xué)檢查，取肝組織后10%福爾馬林固定5 h，酒精梯度脫水2 h，二甲苯透明4 h，包埋，切片機制備厚度4 μm切片，37 ℃烤干后，72 ℃烤片3 h，采取免疫組織化學(xué)法檢測肝組織內(nèi)VDR表達(dá)。

1.4.2 分組方法 采取病理組織學(xué)檢查進行病理組織學(xué)分期。Ⅰ期：匯管區(qū)膠原增多或擴大，輕度竇周纖維化，輕度靜脈周纖維化；Ⅱ期：重度竇周纖維化，小葉內(nèi)纖維分隔，中度靜脈周纖維化；Ⅲ期：多數(shù)纖維間隔出現(xiàn)，小葉結(jié)構(gòu)紊亂；Ⅳ期：早期小結(jié)節(jié)性肝硬化[9]。

1.5 觀察指標(biāo)

比較兩組患者的VDR基因型頻率，并收集兩組臨床特征，包括性別、年齡、病程、Child-Pugh分級、基因型以及血清白蛋白、總膽紅素、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白/谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 VDR在酒精性肝硬化中表達(dá)圖片

VDR在酒精性肝硬化中表達(dá)見圖1，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈棕黃色(箭頭處)，而在細(xì)胞核中基本無表達(dá)。

圖1 VDR在酒精性肝硬化中表達(dá)(免疫組化法圖，200×)

2.2 兩組臨床特征比較

Ⅰ～Ⅱ期組的Child-PughA級、BB基因型頻率、谷丙轉(zhuǎn)氨酶<40U/L占比高于Ⅲ～Ⅳ期組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組臨床特征比較 [n(%)]

表2 量化賦值表

2.3 酒精性肝硬化患者病理進展的危險因素分析

采用Logistic回歸模型對各量表進行量化賦值，見表3，將性別、年齡、病程、Child-Pugh分級、基因型頻率、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶作為自變量納入多因素分析，結(jié)果提示Child-PughC級、bb基因型頻率、谷丙轉(zhuǎn)氨酶≥40 U/L是酒精肝硬化病理進展的獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

2.4 不同VDR基因型頻率患者的肝功能指標(biāo)比較

bb型基因的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平高于Bb、BB型基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，三組血清總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶/谷草轉(zhuǎn)氨酶比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 酒精性肝硬化病理進展危險因素Logistic回歸分析

表4 不同VDR基因型頻率患者的肝功能指標(biāo)比較

注：與bb組比較，*P<0.05

3 討論

酒精性肝硬化具有發(fā)病率高、死亡率高等特點，其發(fā)病與長期酗酒密切相關(guān)[10]。該病以50歲左右男性居多，早期無明顯癥狀，伴或不伴食欲不振、牙齦出血、乏力、體重下降等表現(xiàn)，隨著病情進展，患者會出現(xiàn)明顯癥狀[11-12]。研究表明長期酗酒會減少腸粘膜葉酸吸收，與此同時，肝臟攝取量也明顯下降，致使機體葉酸含量降低[13-14]。此外，長期酗酒會導(dǎo)致肝臟MS活性受到抑制，影響肝臟微循環(huán)，加重肝臟損害[15]。近年來，有研究認(rèn)為VDR基因多態(tài)性參與了多類疾病的進展過程，如腎病、乳腺癌、前列腺癌、乙型肝炎等，并對患者預(yù)后影響非常大[16-17]。VDR在很多組織細(xì)胞內(nèi)均存在，它與腎臟、腸粘膜等鈣磷代謝密切相關(guān)，能調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，充分發(fā)揮生物學(xué)作用[18]。

本次研究針對酒精性肝硬化患者進行研究，結(jié)果提示Ⅰ～Ⅱ期患者的組bb基因型頻率低于Ⅲ～Ⅳ期患者，而BB基因型頻率高于Ⅲ～Ⅳ期患者，表明患者病情嚴(yán)重度與VDR基因多態(tài)性可能存在關(guān)聯(lián)。VDR基因可能對VDRmRNA穩(wěn)定性、表達(dá)水平有調(diào)節(jié)作用，從而影響VDR活性、數(shù)量的變化，使其與DNA結(jié)合能力發(fā)生改變，促進疾病進展[19-20]。1，25-(OH)2D3是機體維生素D活性形式，既往研究發(fā)現(xiàn)它對血磷、血鈣水平有調(diào)節(jié)作用，此外，它還具有調(diào)節(jié)免疫、抗細(xì)胞增殖等功能[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)它能將巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞激活，對淋巴細(xì)胞增殖存在抑制作用，可促使白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素12(IL-12)、γ干擾素(INF-γ)分泌減少[22]。筆者結(jié)合既往研究[23]與本次實踐，認(rèn)為VDR基因多態(tài)性可能通過削弱1，25-(OH)2D3的炎癥、免疫調(diào)節(jié)作用，促進酒精性肝硬化患者病情進展，從而加重疾病嚴(yán)重度。

筆者采用Logistic回歸模型，證實Child-PughC級、bb基因型頻率、谷丙轉(zhuǎn)氨酶≥40U/L是酒精肝硬化病理進展的危險因素。已有研究證實Child-Pugh分級、谷丙轉(zhuǎn)氨酶增高與酒精性肝硬化疾病嚴(yán)重度相關(guān)[24]，與本研究結(jié)論基本吻合。本次研究的創(chuàng)新之處在于證實bb基因型頻率也與酒精性肝硬化病理進展密切相關(guān)。此外，通過分析患者的肝功能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)bb型基因的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平高于Bb、BB型基因，提示bb型基因的患者肝功能損害最重。這可能的機制在于bb基因型利用其對VDRmRNA轉(zhuǎn)錄的影響，從而對其功能、表達(dá)進行抑制，加重體內(nèi)免疫反應(yīng)，而機體部分抗原免耐受功能削弱，導(dǎo)致病情進展[25]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性可促進1，25-(OH)2D3與VDR相結(jié)合，從而對機體免疫進行調(diào)節(jié)，進一步作用于免疫反應(yīng)，影響其反應(yīng)類型、反應(yīng)強度，并調(diào)節(jié)炎癥因子分泌[26]。另有研究提示bb型基因可導(dǎo)致多種炎癥因子水平上調(diào)，如白介素-6(IL-6)、白介素-1(IL-1)等，這可能是bb型基因促進病理進展的機制之一[27]。

綜上，本研究證實隨著酒精性肝硬化患者病理進展，其bb基因型頻率增高，BB基因型頻率下降，且bb基因型頻率增高是患者病理進展的危險因素，該基因型會加重患者肝損害程度，臨床需對此引起重視，便于為疾病治療提供依據(jù)，改善預(yù)后。本次研究的局限性在于因受納入病例時間、研究經(jīng)費的影響，導(dǎo)致樣本量偏少，未來需擴大樣本量進行更深入研究。