響應(yīng)曲面法優(yōu)化樓梯草抗氧化活性物質(zhì)提取工藝

楊建遠(yuǎn)，楊云仙，周筱玲，楊晨旭，張炳火，王萍蘭

（1.九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西九江332000；2.九江學(xué)院旅游與國土資源學(xué)院，江西九江332005）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化樓梯草抗氧化活性物質(zhì)提取工藝

楊建遠(yuǎn)1，楊云仙2，周筱玲1，楊晨旭1，張炳火1，王萍蘭1

（1.九江學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西九江332000；2.九江學(xué)院旅游與國土資源學(xué)院，江西九江332005）

以乙醇溶液為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法對樓梯草抗氧化活性物質(zhì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)的最優(yōu)提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為51%、液料比20∶1（mL∶g）、提取時間50min、溫度85℃、提取2次，優(yōu)化條件下其抗氧化活性物質(zhì)的實(shí)際提取率為1.405%。樓梯草葉、莖中的提取率分別為3.048%、0.516%。

響應(yīng)曲面法；樓梯草；抗氧化活性物質(zhì)；提取工藝

生物體在新陳代謝過程中會不斷地產(chǎn)生自由基。當(dāng)人體內(nèi)自由基過剩時會引起機(jī)體衰老而引發(fā)一系列的疾病，如衰老、冠心病、心腦血管疾病、癌癥等[1]?？寡趸瘎┦且活惸軌虮Ｗo(hù)機(jī)體免受因自由基產(chǎn)生的氧化損傷的重要物質(zhì)。如今抗氧化劑已廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)，而許多植物中的天然抗氧化成分因其安全、健康、無毒而得到人們愈來愈多的關(guān)注[2]。近年來，從植物天然產(chǎn)物中尋找抗氧化劑已成為研究熱點(diǎn)。

樓梯草Elatostema involuratum Franch.et Sav.[E.umbellatum（S.et.Z..）Bl.var.majusMaxim.]為蕁麻科樓梯草屬植物，異名：大傘花樓梯草（《全國中草藥匯編》），細(xì)水麻葉、赤車使者（《湖南藥物志》），驚風(fēng)草（《安徽中草藥》），冷水草、龍含珠、海馬含珠（《陜西中草藥》），半邊山、半邊傘、到老嫩（《貴州民間藥物》）。分布于陜西、安徽、浙江、江西、福建、湖南、河南、四川、貴州、云南等地。生于海拔200m~2 000m的山谷溝邊石上，林中或灌叢中。具有清熱解毒，袪風(fēng)除濕，利水消腫，活血止痛。主治赤白痢疾，風(fēng)濕痹痛，高熱驚風(fēng)，黃疸，水腫，經(jīng)閉，帶狀皰疹，瘡腫，毒蛇咬傷，跌打損傷，骨折等[3]。對樓梯草生物活性物質(zhì)的提取及活性相關(guān)研究，國內(nèi)外鮮見有關(guān)報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化樓梯草抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝，為樓梯草在生物活性物質(zhì)的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

樓梯草莖葉（采自江西九江廬山），六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 樓梯草抗氧化活性物質(zhì)提取工藝的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)抗氧化活性物質(zhì)的提取。選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)對樓梯草提取液抗氧化活性物質(zhì)的提取率的影響，方案見表1，每次3個重復(fù)。

表1 抗氧化活性物質(zhì)提取的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Univariateexperiments for extracting antioxidants

根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定提取次數(shù)為2次，溫度為85℃，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時間3個主要影響因素，分別以A、B和C為代表，每一個自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。以抗氧化活性物質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，確定樓梯草抗氧化活性物質(zhì)的最佳提取工藝。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 響應(yīng)面分析因素與水平Table2 Variablesand levels in response surfacedesign

在最佳優(yōu)化工藝下測定5個平行樣及葉、莖樣品，以驗(yàn)證提取工藝的穩(wěn)定性及測定其在葉、莖中的分布。

1.2.2 樓梯草抗氧化活性物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取干燥粉碎后過60目篩的樓梯草粉末2.00 g，于250mL錐形瓶中，加一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，100 r/min恒溫水浴提取一定時間后取出，及時抽濾得抽濾液，濾出物再提取一次，合并濾液，定容至200mL，再取其中50mL定容至100mL，取1.0mL測定其抗氧化活性物質(zhì)的提取率。

1.2.3 抗氧化活性物質(zhì)的提取率的測定

[4-5]方法，準(zhǔn)確移取樓梯草提取液1.0mL，加入到2.5mL磷酸緩沖液中（0.2moL/L，pH6.6），然后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%六氰合鐵酸鉀（K3Fe（CN6））2.5 mL，50℃水浴30min后，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸2.5mL，混勻，取上清液2.5mL與2.5mL水和0.5mL 0.1%三氯化鐵混勻，靜止10min后，于波長700 nm下測定其吸光值。另以0.000、0.025、0.050、0.075、0.100、0.125mg的VC標(biāo)準(zhǔn)溶液代替待測樣品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度為X軸，吸光度為Y軸得出回歸方程為y=8.049 1x+0.022 4，R2=0.996 5。根據(jù)回歸方程，計(jì)算抗氧化活性物質(zhì)的提取率（%）：Y=（A-0.022 4）×V×100/（8.049 1×m），式中，A為吸光度，V為被測液定容后的總體積；m為樓梯草干粉重量，mg。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Origin 7.5、Design-Expert8.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effectof the concentration of ethanolon yield of antioxidants

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高被測液總還原力逐步提高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時達(dá)到最高值，60%時下降。實(shí)驗(yàn)過程中可能由于多糖的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、45%時較不易抽濾。

2.1.2 液料比對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

液料比對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 液料比對抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effectof liquid/solid ratio on yield ofantioxidants

由圖2可知，隨液料比的增大總抗氧化活性物質(zhì)得率上升趨勢不明顯，當(dāng)液料比在15∶1時就達(dá)最高，隨著液料比的繼續(xù)增加，提取率呈下降趨勢，其原因可能為液料比加大使水溶性物質(zhì)增加醇溶性減少導(dǎo)致。

2.1.3 提取時間對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

提取時間對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effectof extraction timeon yield of antioxidants

由圖3可知，總抗氧化活性物質(zhì)提取率隨著提取時間的增長，呈現(xiàn)先上升后下降的總體趨勢，在40min左右出現(xiàn)最大值。

2.1.4 提取溫度對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

提取溫度對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取溫度對抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effectofextraction temperatureon yield ofantioxidants

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，總抗氧化活性物質(zhì)的提取率呈逐漸升高趨勢，當(dāng)85℃時達(dá)最高值。當(dāng)溫度達(dá)90℃時乙醇揮發(fā)很嚴(yán)重，較難抽提。因此，選取提取溫度為85℃進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.5 提取次數(shù)對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響

提取次數(shù)對總抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取次數(shù)對抗氧化活性物質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effectofextraction num ber on yield of antioxidants

由圖5可知，樣品在前2次提取得率很高，經(jīng)過2次提取后提取率增幅較小，為了簡化工藝、節(jié)約能源及時間，選擇提取次數(shù)為2次進(jìn)行工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)提取工藝條件

響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table3 Processvariablesand levels in response surfacedesign arrangem entand experimental response values

續(xù)表3響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Continue table3 Processvariablesand levelsin response surface design arrangem entand experimental response values

在曲面優(yōu)化試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)號8號樣品在第一次提取過程中出現(xiàn)抽提液很少的現(xiàn)象，可能是在液料比較小而時間較長的條件下，其乙醇揮發(fā)及樣品吸水的影響較大而引起。

采用軟件Design-Expert8.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，分析結(jié)果見表4。

表4 回歸分析結(jié)果Table4 Analysisof variance for quad ric regressionmodel

由表4模型的顯著性檢驗(yàn)可知，B，C，BC，B2呈顯著水平（P＜0.05），B，BC，呈極顯著水平（P＜0.01）。此外，從方差分析結(jié)果可知，R2=0.931 4。對表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得各因素與總抗氧化活性物質(zhì)提取率（Y）響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=1.29-0.046 A+0.16 B-0.052 C+0.021AB-0.012AC+0.12 BC-0.021A2-0.077 B2-0.039C2。經(jīng)Design-Expert8.0軟件處理的響應(yīng)曲面分析結(jié)果圖（見圖6）。

圖6 各因素對提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface showing the interactiveeffectsof extraction factorson yield of antioxidants

通過軟件分析，得醇提法提取樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50.64%，液料比20∶1（mL/g），提取時間50min，提取溫度85℃，提取2次，其理論預(yù)測值為1.421%。但考慮到實(shí)際情況將最佳提取工藝條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，液料比為20∶1（mL/g），提取時間50min，提取溫度85℃，提取2次。在此修正條件下，精密稱取5份樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率分別為：1.440%、1.405%、1.351%、1.408%、1.423%，平均值為1.405%。因此，采用RSM法優(yōu)化得到的提取工藝條件參數(shù)較為準(zhǔn)確，具有一定的實(shí)用價值。測得在葉、莖中的抗氧化活性物質(zhì)提取率分別為3.048%、0.516%。

3 結(jié)論與討論

還原力的測定，可檢驗(yàn)化合物是否為良好的電子供應(yīng)體，它所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，總還原力與抗氧化活性之間存在很好的相關(guān)性[6-7]。本實(shí)驗(yàn)以總還原力為樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)測定指標(biāo)，利用響應(yīng)曲面法對樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)51%，液料比20∶1（mL/g），提取時間50min，提取溫度85℃，提取2次。經(jīng)5次平行提取測定表明與該工藝?yán)碚撝禂M合較好，樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)實(shí)際平均提取率達(dá)到1.405%。在優(yōu)化工藝條件下，分別對葉、莖提取液中的總還原力進(jìn)行測定可知，抗氧化活性物質(zhì)在葉中含量遠(yuǎn)高于莖，得率分別為3.048%、0.516%。因此，本文為樓梯草總抗氧化活性物質(zhì)的生產(chǎn)利用提供了參考數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開發(fā)利用樓梯草抗氧化活性物質(zhì)的成分提供了理論參考。

植物提取物的抗氧化活性成分較復(fù)雜，主要有多糖類化合物、黃酮類化合物、多酚類化合物、生物堿、皂苷類、維生素等類型[8]。不同植物的抗氧化活性成分類型有含量不同，不同類型的抗氧化物質(zhì)的提取工藝條件不同，當(dāng)條件一改變提取的抗氧化活性成分含量也將改變。本實(shí)驗(yàn)以VC為對照品，以總還原力為測定指標(biāo)計(jì)算抗氧化活性物質(zhì)提取率，表明其含量較高。因此，值得進(jìn)一步對抗氧化活性物質(zhì)的主要成分類型進(jìn)行分析。

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Optim ization of Extraction Technology of Antioxidants from Elatostema involuratum Franch.et Sav. by Response Surface M ethodology

YANG Jian-yuan1，YANGYun-xian2，ZHOUXiao-ling1，YANGChen-xu1，ZHANGBing-huo1，WANGPing-lan1

（1.College of Life Sciences，Jiujiang University，Jiujiang 332000，Jiangxi，China；2.College of Tourism and Territorial Resources，Jiujiang University，Jiujiang 332005，Jiangxi，China）

In this article，we used ethanol solution as extrat solvent，according to single-factor experiments，optimizating the extraction technology of antioxidants from Elatostema involuratum Franch.et Sav.by response surfacemethodology（RSM）.The optimum extraction conditions of antioxidants from Elatostema involuratum Franch.et Sav.were obtained as follows：the concentration of ethanol 51%，liquid/solid ratio 20∶1（mL∶g），extraction time50min，extraction temperature85℃，extraction timestwice，theyieldofantioxidantswere1.405% under thiscondition.And theyield ofantioxidants from leavesand stalkswere3.048%，0.516%，respectively.

response surfacemethodology；Elatostema involuratum Franch.et Sav.；antioxidants；extraction technology

2013-08-19

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.009

江西省教育廳科技項(xiàng)目（GJJ13715）

楊建遠(yuǎn)（1979—），男（漢），講師，碩士，主要從事生物技術(shù)及食品功能因子方面的研究。