基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的妊娠期糖尿病患者臍帶血代謝組學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析

吳 衍,張 西,張 潔,張雪芹,申河清

(1.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所,中國科學(xué)院城市環(huán)境與健康重點實驗室,廈門 361021;2.中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049;3.廈門市婦幼保健院,廈門 361003)

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是常見妊娠期并發(fā)癥,其定義為妊娠期間首次檢測出不同程度的糖代謝異常。流行病學(xué)研究[1]指出,我國城鎮(zhèn)地區(qū)妊娠期糖尿病的發(fā)病率在1999～2012年間增加3倍。雖然GDM患者在分娩后糖代謝異常能夠恢復(fù)至正常水平,但其患糖尿病風(fēng)險相較正常孕婦有增加的趨勢,同時圍產(chǎn)期GDM導(dǎo)致的糖脂代謝異常也會對子代遠(yuǎn)期健康產(chǎn)生不利影響[2]。目前研究認(rèn)為胰島素抵抗是導(dǎo)致GDM的重要原因。孕婦通過早期脂肪組織積累以及圍產(chǎn)期脂肪分解加強來滿足胎兒生長的需要,而脂質(zhì)代謝過程的變化直接影響胰島素分泌以及胰島素抵抗水平的改變[3]。其中,圍產(chǎn)期胰島素對于脂質(zhì)分解的抑制作用減弱在GDM孕婦中更為明顯,并且其效應(yīng)會進(jìn)一步導(dǎo)致GDM孕婦餐后脂肪酸累積、肝葡萄糖增加以及更為嚴(yán)重的胰島素抵抗[4]。此外,孕婦脂肪酸小分子可以通過胎盤直接供給胎兒,但對于復(fù)雜的脂質(zhì)則需要通過特定滋養(yǎng)層脂肪酶水解才能通過胎盤轉(zhuǎn)運,因此母親代謝狀態(tài)的改變往往會影響胎兒各類代謝物水平和代謝穩(wěn)態(tài)的改變,進(jìn)而導(dǎo)致如巨大兒、血液中必要元素缺乏、呼吸窘迫綜合征和室間隔增厚等疾病風(fēng)險的增加[5,6]。雖然通過GDM胎盤基因?qū)用娴难芯勘砻?與能量代謝相關(guān)的49個基因表達(dá)發(fā)生了變化,但對于GDM條件下母嬰界面代謝的分子機(jī)制尚不明確[7]。

近年來,隨著色譜分離、質(zhì)譜檢測以及數(shù)據(jù)處理能力的不斷增強,基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建的代謝組學(xué)平臺在疾病診斷、藥物作用機(jī)制以及病理機(jī)制研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[8,9]。代謝物作為基因的下游產(chǎn)物,能夠最直接反應(yīng)疾病與健康之間的表型差異,并且基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)層面的差異能夠在代謝層面上被放大表達(dá)[6]。同時,對于包括飲食、生活習(xí)慣、生存環(huán)境、藥物使用等環(huán)境因子作用下生物體表型的差異,代謝組學(xué)也能夠很好地說明。本課題組[10]前期對于胎便代謝組學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn),GDM條件下胎兒的氨基酸與脂質(zhì)代謝存在差異表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本研究通過非入侵性樣品臍帶血探究GDM條件下母嬰界面之間代謝輪廓的變化,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)分析探究差異代謝物在母嬰代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用,這將有助于理解GDM對子代代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的影響,為孕期并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

UPLC-Q-Exactive超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司);Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國Waters公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(德國Merck公司)色譜純;甲酸和甲醇(色譜純,德國Merck公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);真空濃縮儀(美國Thermo公司)。

1.2 臍帶血樣品收集與制備

本研究通過中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所以及廈門婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。研究人群是橫斷面研究(n=2 602)中的巢式病例對照研究。所有參與者都簽署知情同意,并且樣品排除了包括B組溶血性鏈球菌感染、異常子宮、α地中海貧血、胎膜早破、甲狀腺功能障礙、胎盤障礙、子癇前期、巨大胎兒、胎兒窘迫、高血壓、早產(chǎn)、肩難產(chǎn)等消除混雜因素的影響。所有孕婦均為足月自然分娩孕婦。最終確定了106例孕婦最為研究對象,通過病例回溯,其中31例GDM孕婦作為GDM病例組,而75例無明顯圍產(chǎn)期并發(fā)癥孕婦作為健康對照。臍帶血樣品在孕婦分娩后采集,血液樣品靜置2 h后,以3 000 r/min的速度離心10 min后取上清液,于-80 ℃保存。

根據(jù)文獻(xiàn)方法[11],采用甲醇-血清體系提取代謝物并沉淀蛋白質(zhì),血清樣品解凍后取100 μL于離心管中,加入300 μL甲醇,渦旋1 min。于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min,取上清液于離心管中。上清液于真空離心濃縮儀中濃縮至干燥。將干燥后的提取物復(fù)溶于100 μL甲醇-水(1∶1,v/v)中,渦旋1～2 min至完全溶解,于4 ℃以12 000 r/min的速度離心15 min,取上清液于液相色譜瓶中待上機(jī)檢測。從每個血清樣品中取等量并混合,制備為質(zhì)量控制(QC)樣品待上機(jī)檢測。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

代謝組學(xué)色譜分離采用反向液相分離體系,根據(jù)文獻(xiàn)方法[11,12],采用甲醇-水體系分離血清代謝物,進(jìn)樣量為5 μL,柱溫為40 ℃,樣品室溫度為4 ℃。流動相A為含有0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的超純水,流動相B為含0.1%甲酸的甲醇,流速0.3 mL/min。洗脫梯度:0～1.0 min,100%A;1.0～21.0 min,100%A ～95% B;21.0～22.0 min,95%B～100%B;22.0～24.0 min,100%B;24.0～24.1 min,100%B～100%A;24.1～25 min,100%A。電噴霧離子源分別采用正模式(ESI+)和負(fù)模式(ESI-)采集數(shù)據(jù),全掃描模式下設(shè)定其分辨率為70 000,質(zhì)譜掃描范圍為m/z70～1 000。噴針電壓在正負(fù)模式下均為3 500 V。通過QC樣品對儀器穩(wěn)定性進(jìn)行評估,樣品使用隨機(jī)進(jìn)樣順序,QC樣品平行穿插于整個分析隊列中,每測定20個樣品測定1次QC樣品及空白溶劑。二級質(zhì)譜碰撞能量分別為25、35和45 eV。

表1 GDM病例和健康對照孕婦的人口學(xué)及臨床指標(biāo)Table1 Demographic and clinical data of GDM(gestational diabetes mellitus)case and healthy pregnant women control

p:the statistical significance was assessed using the Mann-Whitney U test.BMI:body mass index.

1.4 數(shù)據(jù)處理

LC-MS離子信息通過Compound Discovery軟件(CD,美國Thermo公司)實現(xiàn)包括峰提取、峰對齊、未知物的檢測、未知物組成預(yù)測以及數(shù)據(jù)庫匹配,并且軟件提供了最后的離子特征峰信息。通過QC-RLSC(quality control-robust LOESS signal correction)模型進(jìn)行QC校正后,獲得的離子信息進(jìn)行求和歸一化,并導(dǎo)入SIMCA-P 14進(jìn)行主成分分析(PCA)以及正交偏最小二乘判別分析模型(OPLS-DA)[11,13]。人內(nèi)源性代謝物鑒定基于HMDB數(shù)據(jù)庫分析。Spearman相關(guān)性分析、均值檢驗以及變化倍數(shù)計算基于MetaboAnalyst在線平臺和SPSS軟件(Version 18);網(wǎng)絡(luò)分析模型采用Gephi軟件;多元線性回歸采用R語言。本研究設(shè)定p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 人口學(xué)及臨床指標(biāo)

參與的106名母親均為足月自然分娩,具體人口學(xué)與臨床指標(biāo)如表1所示。其中,產(chǎn)婦年齡主要集中在25～31歲(占總?cè)巳簲?shù)的25%～75%),孕前身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)指數(shù)為(20.35±3.13)kg/m2(中位數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)。與此前流行病學(xué)研究[14]一致,研究人群中年齡和孕前BMI在疾病對照組間存在顯著性差異。即使排除了其他圍產(chǎn)期并發(fā)癥等混雜因素的影響,BMI和GDM之間相關(guān)性依然存在,說明產(chǎn)前母親肥胖與GDM之間的相關(guān)性相對獨立。因此,孕婦產(chǎn)前超重或肥胖導(dǎo)致的代謝環(huán)境的改變可能是GDM發(fā)病的一個重要因素[15]。

2.2 血清代謝物譜差異分析

利用UPLC-Q-Exactive-MS平臺,采用正負(fù)兩種離子源模式采集臍帶血代謝物質(zhì)量信息,代謝輪廓譜圖如圖1所示。本研究利用QC-RLSC模型校正因儀器長時間運行產(chǎn)生的信號誤差。QC樣品在非監(jiān)督學(xué)習(xí)模型PCA得分圖中明顯聚類且聚類范圍較小,說明儀器測定離子信息保留時間和離子強度重現(xiàn)性好,數(shù)據(jù)滿足代謝組學(xué)分析要求(見圖2)。

基于CD軟件提取離子特征峰信息,通過HMDB數(shù)據(jù)庫比對,本研究確認(rèn)了136個內(nèi)源性代謝物,其中與脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝相關(guān)的內(nèi)源性代謝物分別占37.5%和30.8%。內(nèi)源性代謝物種類鑒定說明母嬰代謝物質(zhì)交換過程中氨基酸和脂質(zhì)類代謝物是重要的組成部分,并且已有研究表明GDM產(chǎn)婦臍帶血中支鏈氨基酸、芳香族氨基酸以及脂肪酸含量與健康產(chǎn)婦臍帶血中的含量有明顯差異[4]。

為了說明GDM孕婦臍帶血的代謝變化,并且減少代謝物相互關(guān)系對于差異代謝物判別能力的影響,本試驗采用OPLS-DA鑒定不同表型下顯著的差異代謝物。如圖2所示,OPLS-DA結(jié)果表明,GDM孕婦與健康孕婦之間臍帶血代謝輪廓存在明顯差異。根據(jù)均值檢驗、變化系數(shù)以及判別式模型重要性分析結(jié)果鑒定出與脂質(zhì)代謝相關(guān)的5個代謝標(biāo)志物,包括四氫可的松(tetrahydrocortisone)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)、酮基膽固醇(7-ketocholesterol)、膽甾-4,6-二烯-3-酮(cholesta-4,6-dien-3-one)以及酰肉堿(9,12-hexadecadienoylcarnitine,acyl carnitine C16∶2)(見表2)。同時,GDM代謝標(biāo)志物分析表明,5個差異代謝物在GDM孕婦臍帶血中顯著降低,這也說明GDM表型下母嬰界面脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的異常變化(見圖3)。

圖1 臍帶血清代謝輪廓譜圖Fig.1 Metabolic profiling of umbilical cord serum Control:healthy pregnant woman metabolome;case:GDM pregnant woman metabolome.

圖2 臍帶血清代謝組分析Fig.2 Umbilical cord serum metabolomics analysis a.metabolic profiling of umbilical cord serum;b.quanlity control (QC)clustering results in principal component analysis (PCA)score plots;c.metabolome OPLS-DA (orthogonal partial least squares discriminant analysis)score plots of umbilical cord serum.In PCA,the circles and the stars are umbilical cord blood samples and QC,respectively.In OPLS-DA,the black dots and the triangles are GDM cases and health control,respectively.Sample:GDM case sand health pregnant woman control metabolomes.

表2 GDM的代謝標(biāo)志物Table2 GDM metabolic markers

VIP:variable influence on projection;FC:fold change between healthy control and GDM case groups;p:the statistical significance was assessed using the Mann-Whitney U test.

圖3 GDM標(biāo)志代謝物小提琴圖Fig.3 Violin plot of GDM metabolic markers * indicates p<0.05;** indicates p<0.01.The red columns represent MS/MS fragments (from Table 2)which match the HMDB database.

2.3 標(biāo)記代謝物與脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

與核磁共振波譜法和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)相比,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺對于血液和尿液中代謝物檢測覆蓋度更廣,這也為網(wǎng)絡(luò)分析提供了可能性。本研究的GDM代謝標(biāo)志物與脂質(zhì)相關(guān),因此構(gòu)建GDM代謝標(biāo)志物的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)能夠進(jìn)一步說明GDM母親臍帶血的代謝變化?；赟pearman相關(guān)性結(jié)果,設(shè)定相關(guān)系數(shù)閾值(β0=0.5)考察中等相關(guān)強度的核心代謝網(wǎng)絡(luò)。利用OpenOrd算法剔除非相關(guān)獨立節(jié)點,通過力導(dǎo)向布局算法ForecAtlas2構(gòu)建脂質(zhì)代謝拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。如圖4a所示,其中溶血卵磷脂和脂肪酸類代謝物構(gòu)建起核心脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò),而在妊娠期糖尿病孕婦胎盤基因表達(dá)的研究中也發(fā)現(xiàn)與能量代謝相關(guān)的49個明顯變化的基因中有67%與脂質(zhì)通路相關(guān),而與葡萄糖代謝通路有關(guān)的基因僅占9%[7]。同時,代謝標(biāo)志物中花生四烯酸(AA)與核心代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性較強,而其他代謝標(biāo)志物與脂肪酸能量代謝過程中的三羧酸循環(huán)通路相關(guān)。通過網(wǎng)絡(luò)模塊化分析表明(模塊解析度1.5),GDM孕婦臍帶血代謝標(biāo)志物中花生四烯酸的變化會直接影響其通路相關(guān)代謝物白三烯A4(LTA4)、前列腺素E2(PGE2)的變化(見圖4b)。

進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性分析(網(wǎng)絡(luò)加權(quán)度),結(jié)果如圖4所示,網(wǎng)絡(luò)節(jié)點大小與其在脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中重要性成正比,表明GDM標(biāo)記代謝物中花生四烯酸(AA)與脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點顯著相關(guān)。同時,在BMI和年齡作為校正因素下,多元線性回歸模型的結(jié)果也表明臍帶血中AA含量與母親是否患有GDM存在顯著相關(guān)性(見表3)。

圖4 脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Network analysis of lipid metabolism a.correlation between the metabolic biomarkers and the key network of lipid metabolism.The red and green dots were GDM metabolic biomarkers and key metabolic network nodes,respectively.b.module analysis of the lipid metabolism network.The different colors correspond to different modules using modularization analysis of metabolic networks.AA:arachidonic acid;EPA:eicosapentaenoic acid;PGE2:Prostaglandin E2;LTA4:leukotriene A4.

表3 GDM代謝標(biāo)志物脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)重要性分析Table3 Weight analysis of GDM metabolic markers in the network of lipid metabolism

pwas tested using multiple linear regression,and the adjustment factors were BMI and age.

2.4 臍帶血代謝標(biāo)記物相關(guān)的代謝過程

本研究發(fā)現(xiàn)GDM條件下,母嬰交互界面中不飽和脂肪酸代謝發(fā)生了顯著性變化,其中生物標(biāo)志物花生四烯酸在GDM臍帶血中含量明顯偏低(見圖3),并且其代謝過程對于整體脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)影響較為顯著。相關(guān)分子生物學(xué)研究[16]表明,細(xì)胞膜磷脂脂肪酸的成分對于胰島素分泌及其自身生物學(xué)效應(yīng)都有重要的作用,特別是AA以及二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid (22∶6n-3),DHA)對胰島素抗性的影響。同時,部分研究[5,17]通過比較健康和GDM母親血清和臍帶血中非飽和脂肪酸含量也表明,GDM母親血液以及臍帶血中AA與DHA的含量顯著偏低,但是GDM母親臍帶血中飽和脂肪酸的比例明顯升高。雖然沒有證據(jù)表明是胎盤轉(zhuǎn)運或者是母親自身代謝異常導(dǎo)致脂質(zhì)組分的變化,但是包括AA與DHA在內(nèi)的n-6和n-3不飽和脂肪酸在臍帶血中含量的減少會導(dǎo)致胎兒對相應(yīng)脂肪酸利用率的增強,而其代謝穩(wěn)態(tài)的改變可能會影響子代長期健康狀態(tài)[5]。另一方面,本研究發(fā)現(xiàn)在AA影響的核心網(wǎng)絡(luò)中,溶血磷脂酰膽堿(LPC)也是其中一個重要組成部分,而目前LPC代謝在孕期對母嬰健康的影響還尚未確定。

3 結(jié)論

本研究通過液相色譜-質(zhì)譜對人臍帶血血清代謝組學(xué)研究,鑒定了與脂質(zhì)代謝相關(guān)的5個潛在生物標(biāo)志物。通過標(biāo)志物與GDM臍帶血脂質(zhì)代謝物的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析說明,GDM條件會對母嬰之間脂質(zhì)代謝特別是不飽和脂肪酸產(chǎn)生影響。本研究提供了評估代謝標(biāo)志物生物學(xué)權(quán)重的新思路,發(fā)揮液相色譜-質(zhì)譜優(yōu)勢,提高了代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的利用率,同時也為組學(xué)在GDM病理研究和治療以及多組學(xué)結(jié)合的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了可行的方法。