植物樣品中內(nèi)源性植物激素時(shí)空分布的研究進(jìn)展

李玉璇,段春鳳,關(guān)亞風(fēng)

(1.中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧 大連 116023;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

內(nèi)源性植物激素是植物體自身合成的、控制其生長(zhǎng)發(fā)育的一類微量或痕量信號(hào)分子。內(nèi)源性植物激素是具有高度活性的小分子化合物,它們參與調(diào)控了植物體的整個(gè)生長(zhǎng)周期,包括植物組織(或器官)的萌發(fā)、生長(zhǎng)、分化、成熟、衰亡與休眠等過(guò)程,幾乎在植物體每個(gè)生命過(guò)程中都發(fā)揮著不可替代的作用[1]。植物激素能夠調(diào)節(jié)植物對(duì)外界刺激(如溫度、損傷、水分等)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),在植物體對(duì)抗外界脅迫過(guò)程中同樣起到重要作用[1,2]。通過(guò)調(diào)節(jié)植物激素在植物體內(nèi)的代謝過(guò)程,可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育,提高作物的品質(zhì)和產(chǎn)量[2]。因此,植物激素的相關(guān)研究在分析化學(xué)、植物學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域被廣泛關(guān)注。

表1 主要植物激素的理化性質(zhì)及作用Table1 Physical and chemical properties and effects of the main phytohormones

pKa:acidity coefficient;logP:partition coefficient;ABA:abscisic acid;CTKs:cytokinins;GAs:gibberellins;BRs:brassinosteroids;JA:jasmonic acid;SA:salicylic acid;-:no data.

近年來(lái)我國(guó)研究者在植物激素檢測(cè)方面取得了一系列研究成果,大量對(duì)植物激素的定性定量分析方法不斷涌現(xiàn),大大提高了我國(guó)在這一領(lǐng)域的技術(shù)水平[3-5]。2010年，白玉等[6]綜述了5類植物激素的檢測(cè)技術(shù),并指出超微量、高靈敏的準(zhǔn)確定性定量方法研究是未來(lái)應(yīng)深入研究的一個(gè)方向;閆存玉和褚金芳團(tuán)隊(duì)[7]從提取純化與分析檢測(cè)方法方面綜述了植物激素定量分析方法的研究進(jìn)展;關(guān)亞風(fēng)團(tuán)隊(duì)[8]對(duì)植物激素的樣品前處理方法進(jìn)行了綜述;2017年,陳義團(tuán)隊(duì)[9]以超痕量植物激素檢測(cè)為主線綜述了當(dāng)前植物激素檢測(cè)方法學(xué)研究的進(jìn)展。從這些綜述中可以看出我國(guó)研究者在痕量植物激素分析方法研究中的貢獻(xiàn)。

植物激素是在植物體內(nèi)可遷移的有機(jī)組分,可以從植物體的產(chǎn)生部位運(yùn)輸至作用部位,進(jìn)而調(diào)控植物體的生長(zhǎng)發(fā)育。因此,植物激素在植物體內(nèi)的時(shí)空分布信息是從分子層面探索植物激素調(diào)控植物生理生化作用機(jī)理的基礎(chǔ)。如何從限量的活體植物樣品中測(cè)定痕量甚至超痕量激素的時(shí)空變化,是當(dāng)前內(nèi)源性植物激素分析的一大挑戰(zhàn)[8]。本文以植物激素的時(shí)空分布為主題,綜述了近5年來(lái)植物激素在植物體內(nèi)時(shí)空分布測(cè)定方法的相關(guān)進(jìn)展,從時(shí)空分布研究的難點(diǎn)、分析方法和植物激素時(shí)空分布情況等幾個(gè)方面進(jìn)行了簡(jiǎn)要總結(jié)與討論。

1 常見(jiàn)的植物激素及其分析難點(diǎn)

根據(jù)植物激素化學(xué)性質(zhì)及其對(duì)植物體作用的不同[1],目前國(guó)際上公認(rèn)將植物激素分為幾大類:生長(zhǎng)素(auxins)、脫落酸(abscisic acid,ABA)、細(xì)胞分裂素(cytokinins,CTKs)、赤霉素(gibberellins,GAs)、油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)、乙烯(ethylene,ETH)、水楊酸(salicylic acid,SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)及其衍生物等。常見(jiàn)植物激素的理化性質(zhì)和作用見(jiàn)表1，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 主要植物激素代表物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of main representative phytohormones

不同植物激素在植物體中含量分布不同,通常在ng/g鮮重(FW)甚至pg/g FW數(shù)量級(jí)水平。生長(zhǎng)素、ABA、CTKs、JA、SA在植物體中的含量較高[10,11],通常為1～1 000 ng/g FW;赤霉素含量為0.1～100 ng/g FW,較之含量低3～4個(gè)數(shù)量級(jí)[10];而B(niǎo)Rs含量最低,花粉及未成熟的種子中其含量為1～100 ng/g FW,在葉片及葉芽中則低至0.01～0.1 ng/g FW[11]。植物激素通常不穩(wěn)定,對(duì)環(huán)境(溫度、光照、pH等)較為敏感,如赤霉素對(duì)環(huán)境pH值敏感,在偏酸性條件下才可保持較穩(wěn)定狀態(tài),且當(dāng)環(huán)境溫度高于40 ℃時(shí)易產(chǎn)生變化[9,12]。植物激素多數(shù)不含可以被高靈敏檢測(cè)的基團(tuán),且同類別植物激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)大多相似,存在較多同分異構(gòu)現(xiàn)象[9]。植物體基質(zhì)成分組成復(fù)雜,生物環(huán)境多變,對(duì)植物激素的分離檢測(cè)造成很大干擾[8],這對(duì)植物激素的定量分析提出了更高要求。

若要獲得植物激素的時(shí)空分布信息,建立分析方法時(shí)將面臨以下幾個(gè)難題。

(1)取樣難:時(shí)空分布研究往往需要從整株植物樣品中將需要分析的組織器官剝離出來(lái)。如何在剝離過(guò)程中保持樣品中植物激素的原有水平和分布狀態(tài),盡可能降低甚至消除取樣帶來(lái)的誤差,是建立時(shí)空分析方法的首要難題。

(2)稱量難:與整株植物平均含量分析不同,空間分布的測(cè)定通常僅局限于植物體的某些組織器官,樣品量非常有限,通常在幾十微克至幾毫克水平[4,10]。為獲得準(zhǔn)確的樣品質(zhì)量,需要高精密的天平(十萬(wàn)分之一甚至百萬(wàn)分之一天平[8])進(jìn)行稱量,普通的分析實(shí)驗(yàn)室難以實(shí)現(xiàn)。

(3)分析難:由于時(shí)空分布研究的樣品量少,待測(cè)植物激素的質(zhì)量?jī)H在pg甚至fg數(shù)量級(jí),這種超痕量分析對(duì)分析方法的靈敏度是一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

2 植物激素的時(shí)空分布分析方法進(jìn)展

2.1 取樣方法

植物激素的測(cè)定通常為離體或體外分析。為了使植物樣品最大限度地保持其原始激素水平,通常在采摘后用液氮將樣品迅速冷凍[13-16]。液氮冷凍后的樣品可以儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中,待要進(jìn)行樣品前處理時(shí)再取出。這是目前植物激素測(cè)定的主流取樣方法。而對(duì)于植物激素的時(shí)空分布測(cè)定,取樣過(guò)程通常需要對(duì)植物樣品的組織器官進(jìn)行剝離,由此造成的損傷很可能會(huì)使植物體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而導(dǎo)致植物激素水平的變化。Pan等[17]測(cè)定研究了擬南芥葉片受機(jī)械損傷后其多種植物激素的含量變化情況,發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷對(duì)JA、ABA、SA等激素的影響較大,而GAs、ZT、IAA等激素對(duì)機(jī)械損傷不敏感(見(jiàn)表2)。褚金芳課題組[18]對(duì)于水稻受傷葉片中6種內(nèi)源性植物激素含量進(jìn)行定量測(cè)定,同樣發(fā)現(xiàn)機(jī)械損傷會(huì)對(duì)ABA、JA植物激素產(chǎn)生影響,而IAA、吲哚-3-丙酸(IPA)、IBA幾種植物激素對(duì)機(jī)械損傷不敏感。因此,測(cè)定對(duì)機(jī)械損傷不敏感的激素時(shí),可以在常溫下對(duì)新鮮植物樣品進(jìn)行器官剝離或切割取樣。2002年,Muller等[19]采用手術(shù)刀片在常溫下對(duì)擬南芥葉片進(jìn)行切割,分析其中包括IAA等酸性植物激素的分布情況。本課題組[10]此前在室溫下將單片擬南芥葉片切割成15個(gè)小片,以此測(cè)定赤霉素的含量分布。而對(duì)于那些對(duì)機(jī)械損傷敏感的激素,則應(yīng)采用先“固定”后取樣的方案,即先采用液氮冷凍，固定激素后進(jìn)行敲擊剝離[4,14]植物組織器官。例如,Meulebroek等[20]在液氮環(huán)境下處理番茄葉片組織,測(cè)定其中ABA、JA、SA等8種植物激素。然而這一方法是否可以有效減少機(jī)械損傷帶來(lái)的影響還有待考察。另外,對(duì)于除葉片以外的其他植物組織器官中植物激素含量受機(jī)械損傷的影響情況是否與葉片一致也需要進(jìn)一步研究。

表2 損傷誘導(dǎo)擬南芥葉片中植物激素1 h內(nèi)的變化[17]Table2 Wound-induced changes of phytohormones in Arabidopsis leaf in1 h[17]

-:no significant changes;↑:content increase;MeBA:benzoic acid methyl ester;MeCA:cinnamic acid methyl ester.

2.2 樣品前處理

植物激素的時(shí)空分布測(cè)定是對(duì)微量樣品的超痕量分析,存在樣品量少、準(zhǔn)確稱量困難、基質(zhì)干擾嚴(yán)重等特點(diǎn),對(duì)樣品前處理和儀器分析方法都提出了更高的要求。當(dāng)儀器分析方法的靈敏度不足以進(jìn)行單個(gè)組織器官的分析時(shí),常常需要通過(guò)增加樣本量來(lái)彌補(bǔ),如從多個(gè)植株中采摘相同的組織器官合并成一個(gè)樣本[21,22],這種方法測(cè)定的結(jié)果為多個(gè)植株的平均值,植株的個(gè)體差異會(huì)被掩蓋,影響分析結(jié)論的準(zhǔn)確性。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外研究人員從提取效率、除雜方法、化學(xué)衍生等方面不斷提高分析方法的靈敏度,開(kāi)發(fā)出更為高效的樣品前處理方法,實(shí)現(xiàn)了單個(gè)組織器官的植物激素測(cè)定[4,10,14]。表3匯總了近年來(lái)植物激素時(shí)空分布研究中使用的樣品前處理方法。

對(duì)于微克至亞毫克樣品的稱重,普通的萬(wàn)分之一天平已經(jīng)難以勝任。在缺乏更高精度天平的情況下,一般只能獲得樣品(某種組織器官)的平均重量,即稱量多個(gè)相同的組織器官,計(jì)算單個(gè)樣品重量的平均值[9]。

對(duì)于如此微量的植物樣品,提高樣品利用率是前處理過(guò)程的關(guān)鍵。目前,將植物樣品在液氮環(huán)境下研磨后過(guò)夜(～12 h)浸提仍是植物激素分析中最常用的前處理步驟,通常采用甲醇、乙腈等作為萃取溶劑。然后采用液-液萃取或固相萃取等方式進(jìn)行二次萃取、富集與除雜凈化。例如,Xin等[26]采用95%(v/v)甲醇水溶液浸提,經(jīng)SPE凈化后,進(jìn)行衍生后進(jìn)樣分析。目前固相萃取主要采用的吸附劑包括十八烷基鍵合相硅膠(C18)、辛基鍵合相硅膠(C8)、混合型強(qiáng)陰離子交換材料(MAX)、混合型強(qiáng)陽(yáng)離子交換材料(MCX)和親水-親油平衡聚合物材料(HLB)等填料。

表3 近期植物激素時(shí)空分布研究中的樣品前處理方法總結(jié)Table3 Summary of sample preparation method for the recent research on spatial-temporal distribution of phytohormones

FW:fresh weight;HF-LLLME:hollow fiber-liquid-liquid-liquid micro-extraction;MSPE:magnetic solid phase extraction;on-line 2DμSPE-ODO:on-line two-dimensional microscale SPE-on column derivatization;MSPD:matrix solid phase dispersion;* without overnight liquid extraction process;LLE:liquid-liquid extraction;/:without other extraction and purification steps except for overnight liquid extraction;DMSPE:dispersive matrix solid phase extraction;-:with many plant organs as the sample for determination;√:with single plant organ as the sample for determination;MPyBA:6-methoxy-3-pyridinylboronic acid;m-APBA:m-aminophenylboronic acid;EDC:N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide;BPTAB:3-bromopropyltrimethylammonium bromide;AYBA:N-(acridin-9-yl)-2-bromoacetamide;DEED:N,N-diethyl ethylenediamine;2-methyl-4-PAMBA:2-methyl-4-phenylaminomethyl-benzeneboronic acid;BTBA:4-borono-N,N,N-trimethylbenzenaminium iodide.

由于植物樣品為固體,可以采用基質(zhì)分散固相萃取的方式處理微量植物樣品,即在液氮環(huán)境下研磨樣品,而后利用SPE或分散固相萃取等方法進(jìn)行凈化。本課題組[21]為縮短樣品前處理時(shí)間避免過(guò)夜浸提,采用了MSPD-串聯(lián)SPE(MSPD-MAX-MCX)的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)水稻樣品中6種BRs的測(cè)定,對(duì)比傳統(tǒng)LLE方法,有效提高了BRs的回收率,但方法樣品轉(zhuǎn)移步驟較多且前處理時(shí)間較長(zhǎng)(>1 h)。在此基礎(chǔ)上,本課題組[10]開(kāi)發(fā)了一種微型化MSPD方法,實(shí)現(xiàn)了在亞毫克樣品中對(duì)GAs的檢測(cè)。將樣品置于微型離心管中于液氮環(huán)境下采用C18分散劑研磨,加入乙腈萃取后離心處理,大大減少了前處理時(shí)間(<1 h),且集提取凈化于同一離心管內(nèi),處理過(guò)程中無(wú)樣品轉(zhuǎn)移,降低了樣品損失,這對(duì)于微量樣品的處理是十分有利的。而對(duì)于BRs的檢測(cè),僅僅使用C18處理無(wú)法滿足對(duì)BRs測(cè)定的基質(zhì)凈化,故本課題組[15]在微型化MSPD的基礎(chǔ)上加入MAX-MCX進(jìn)一步凈化,并發(fā)現(xiàn)不同復(fù)雜程度的樣品基質(zhì),其最佳的分析步驟不同。這種結(jié)合了MSPD和dSPE的方法暫命名為分散基質(zhì)固相萃取,它避免了傳統(tǒng)MSPD方法中轉(zhuǎn)移樣品-吸附劑混合物填裝SPE柱的過(guò)程,可以降低樣品轉(zhuǎn)移帶來(lái)的損失。

為了提高微量樣品中痕量植物激素檢測(cè)的靈敏度,在現(xiàn)有的儀器條件下,采用化學(xué)衍生是目前最有效的手段。在使用MS作為檢測(cè)器時(shí),化學(xué)衍生可以有效地提高離子化效率從而提高質(zhì)譜的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于常見(jiàn)的幾類植物激素的測(cè)定,尤其是在測(cè)定植物樣品中含量極低且在MS分析中低電離效率的GAs和BRs時(shí),通常需要在進(jìn)樣分析前進(jìn)行衍生化處理從而提高靈敏度。在時(shí)空分布的測(cè)定中,Xiao等[25]運(yùn)用計(jì)算化學(xué)設(shè)計(jì)一種新型的衍生試劑N-(吖啶-9-基)-2-溴乙酰胺進(jìn)一步提高羧酸類植物激素的衍生效果;Li等[4]將在乙醇環(huán)境中的N-(3-二甲基丙基)-N′-乙基碳二亞胺作為GAs的衍生試劑,實(shí)現(xiàn)了同時(shí)對(duì)單、雙羧基的GAs的衍生,有效提高了GAs的測(cè)定靈敏度;本課題組[10]采用新型衍生試劑3-溴丙基三甲基溴化銨對(duì)GAs進(jìn)行衍生,可將其MS靈敏度提高560～7 600倍,且最低可衍生水平達(dá)到1 pg/mL(～1 fg/mg),同時(shí)將BPTAB試劑與此前報(bào)道的2-溴乙基三甲基溴化銨(BETA)[27]及3-溴丙酮基三甲基溴化銨(BTA)[28]兩種試劑的衍生效果進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)采用BPTAB試劑時(shí)靈敏度更高;對(duì)于BRs的衍生,本課題組[13]設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一種碘化4-二羥基硼基-N,N,N-三甲基苯胺衍生試劑用于BRs化學(xué)衍生反應(yīng),將BRs的檢測(cè)靈敏度提高了1 100～448 700倍;Cai等[14]采用N,N-二乙基乙二胺與2-甲基-4-苯基氨基甲基-苯硼酸兩種衍生試劑用于CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs的衍生化反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了同時(shí)衍生處理包括BRs在內(nèi)的31種植物激素。

2.3 檢測(cè)方法

基于LC的高效分離能力與MS或MS/MS的高選擇性和高靈敏度,LC-MS或LC-MS/MS已經(jīng)成為目前植物激素分析的主流檢測(cè)方法。其中MRM模式更為同時(shí)檢測(cè)多種植物激素提供了便利,成為目前植物激素定量分析的首選。但是,當(dāng)前植物激素標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類較少,能獲得同位素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)樣品種類更少。為了提高現(xiàn)有質(zhì)譜檢測(cè)植物激素的可靠性,開(kāi)展相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)樣品制備技術(shù)的研究是十分必要的。目前,馮鈺錡團(tuán)隊(duì)[29,30]通過(guò)穩(wěn)定同位素標(biāo)記的衍生試劑衍生植物激素標(biāo)準(zhǔn)品,以其作為內(nèi)標(biāo)物,可以部分解決同位素內(nèi)標(biāo)難以獲得的問(wèn)題。

需要說(shuō)明的是,除了本文提到的取樣-前處理-色譜-質(zhì)譜分離檢測(cè)方案外,植物學(xué)家還通過(guò)測(cè)定與植物激素生物合成或代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)產(chǎn)物,來(lái)間接獲取植物激素的時(shí)空分布信息。但是這種方法很難做到同時(shí)監(jiān)測(cè)多種植物激素,且通過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)物無(wú)法準(zhǔn)確獲得某種激素的濃度信息。

另一方面,在植物激素的時(shí)空分布研究中成像技術(shù)也有相關(guān)的應(yīng)用,如熒光成像[31]、質(zhì)譜成像[32,33]等。但成像分析的局限性比較明顯,比如熒光成像需要將熒光標(biāo)記物引入植物體內(nèi),這個(gè)操作很可能引起植物的應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生激素水平的變化,因此反映出的濃度難以代表內(nèi)源性激素的真實(shí)值。質(zhì)譜成像一般只能檢測(cè)植物樣品表面,對(duì)于植物體內(nèi)部的激素,需要切片等操作,會(huì)對(duì)植物體造成機(jī)械損傷;而且其使用的離子化手段對(duì)植物體的影響尚不清晰。因此,本文不對(duì)植物激素的成像分析展開(kāi)更深入的討論。

3 植物激素的時(shí)空分布研究

3.1 不同生長(zhǎng)期含量變化的研究

對(duì)于植物激素在植物體內(nèi)隨時(shí)間變化的研究,尤其是不同生長(zhǎng)期的植物激素的檢測(cè),可以通過(guò)采集多顆植物樣品而獲得較大的樣品量。王澤文等[34]采用SPE與HPLC-MS/MS結(jié)合的方法測(cè)定了IAA、IBA、ABA、ZT等4種植物激素在海帶薄嫩期、厚成期及成熟期的含量,發(fā)現(xiàn)ZT與ABA在成熟期含量最高,IAA在薄嫩期最高,而IBA含量最高出現(xiàn)在厚成期。Cai等[22]采用dSPE-UPLC-MS/MS方法測(cè)定了水稻在不同生長(zhǎng)時(shí)期包括生長(zhǎng)素、ABA、CTKs、JA、SA、GAs等54種植物激素的含量變化。Xiao等[26]采用LLE-UPLC-MS/MS監(jiān)測(cè)了28 ℃溫度下IAA、JA、ABA在單顆水稻種子萌發(fā)期的72 h中的含量變化,發(fā)現(xiàn)在種子的胚中IAA的含量在0～12 h間迅速增加,達(dá)到峰值后略有減少;ABA自萌發(fā)開(kāi)始后12 h內(nèi)含量急劇減少而后趨于平穩(wěn);而JA含量在萌發(fā)期緩慢增加并在60 h后趨于穩(wěn)定。Li等[4]通過(guò)LLE-UPLC-MS/MS在對(duì)擬南芥花器官不同花期(花期13～15)中18種GAs含量的研究中發(fā)現(xiàn),GAs含量隨花期呈現(xiàn)出不同增減規(guī)律,如隨著花期的發(fā)展沿活性GA4代謝路徑中的GAs含量會(huì)有所增加。Cai等[14]采用過(guò)夜浸提結(jié)合UPLC-MS/MS定量分析了CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs中12種植物激素在擬南芥花期13和15中的含量(見(jiàn)圖2),樣品量為0.02～5 mg,是目前報(bào)道的最少用量。本課題組[21]采用MSPD-串聯(lián)SPE-HPLC-MS/MS測(cè)定孕穗期和成熟期水稻葉片中的BRs,發(fā)現(xiàn)在不同生長(zhǎng)階段水稻BRs具有明顯的差異性,其中在孕穗期樣品中扁豆甾酮(DS)含量明顯高于其他幾種,從孕穗期到成熟期24-表油菜素內(nèi)酯的含量在增加,而DS含量明顯減少。

圖2 花期13和15時(shí)擬南芥的(a)花器官和(b)花藥、雌蕊中內(nèi)源性植物激素的含量[14]Fig.2 (a)Floral organs and(b)contents of endogenous phytohormones in anther and pistil of Arabidopsis thaliana against floral stages13 and15[14]

3.2 空間及地域差異的研究

近年來(lái)在植物體的細(xì)胞、組織、器官水平上均有相關(guān)的研究工作。在植物細(xì)胞水平上,Jiskrová等[35]選取了單子葉植物擬南芥葉片和雙子葉植物大麥兩種模式植物的葉片細(xì)胞,采用SPE及微型SPE方法結(jié)合UPLC-MS/MS測(cè)定了CTKs除液泡外細(xì)胞內(nèi)、液泡內(nèi)以及細(xì)胞外間隙的空間分布,發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)CTKs分布在細(xì)胞外間隙中。在植物組織水平上,賈鵬禹等[36]通過(guò)在線SPE-HPLC-MS/MS方法測(cè)定了大豆葉片、莢皮、籽粒中IAA、ABA、ZT、GA3的含量,發(fā)現(xiàn)籽粒中ABA含量明顯較高;張莉等[37]采用LLE-HPLC-UV方法探索了楊樹(shù)枝條的尖梢、基部、上端IAA、ABA、GA、ZR等4種植物激素與枝條分枝角度發(fā)育的關(guān)系;本課題組[10]利用微型MSPD-UPLC-MS/MS方法測(cè)定擬南芥單片葉子上8種GAs的空間分布(空間分辨率為2×2 mm,樣本質(zhì)量0.3～0.8 mg),發(fā)現(xiàn)GA19的含量在單片擬南芥葉上呈現(xiàn)差異分布,葉柄處含量最高(見(jiàn)圖3)。在植物的器官水平上,Li等[4]在低溫下剝離擬南芥花器官(雄蕊、雌蕊、花瓣、萼片及花托),并采用LLE結(jié)合UPLC-MS/MS測(cè)定其中GAs的空間分布,發(fā)現(xiàn)不同植物激素在不同花器官中存在明顯的差異性,如在雌蕊中GA19大量出現(xiàn),疑似為GA19的合成位點(diǎn);Cai等[14]采用UPLC-MS/MS檢測(cè)CTKs、IAA、ABA、JA、SA、GAs及BRs的31種植物激素并定量分析其中的12種在擬南芥單花不同生殖器官中的分布;Xin等[26]采用MSPE-UPLC-MS/MS測(cè)定了BRs在擬南芥和水稻莖、葉、穗等不同器官的含量分布,探索了BRs與水稻表型的關(guān)系。

在地域差異的測(cè)定中,本課題組[15]利用DMSPE-HPLC-MS/MS測(cè)定對(duì)比了長(zhǎng)江流域不同省份甘藍(lán)型油菜籽中5種內(nèi)源性BRs。結(jié)果表明:不同油菜素甾醇含量具有差異,其中6-脫氧-24-表油菜素甾酮含量最高且明顯高于其他4種;不同省份選取的樣品中,d-epiCS含量呈現(xiàn)差異性,其中湖北省的樣品中其含量最高(見(jiàn)圖4)。

4 結(jié)論與展望

近年來(lái),內(nèi)源性植物激素的時(shí)空分布研究取得了很大進(jìn)步,但仍存在不少技術(shù)難題,對(duì)活體植物中多種植物激素的原位、實(shí)時(shí)、高分辨率檢測(cè)仍未突破。目前,主流的時(shí)空分布研究仍采用活體取樣-離體樣品前處理-色譜-質(zhì)譜分析策略,取樣方式的有效性有待進(jìn)一步確認(rèn);液氮研磨、長(zhǎng)時(shí)間浸提等前處理過(guò)程限制了植物激素動(dòng)態(tài)檢測(cè)的時(shí)間分辨率;而空間分辨率則受取樣方法、稱量精度和方法靈敏度等多因素影響。另一方面,植物激素調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的生理機(jī)制并非單一的,而是多類激素協(xié)同作用的結(jié)果。單類激素的時(shí)空分布信息不足以反映激素調(diào)控植物生理過(guò)程的全貌。因此,當(dāng)前植物激素的時(shí)空分布測(cè)定技術(shù)離植物學(xué)研究的前沿需求仍有很大差距。

筆者認(rèn)為,以下幾個(gè)方面可能成為該領(lǐng)域未來(lái)發(fā)展的主要方向。

圖3 單片擬南芥葉上GAs的空間分布[10]Fig.3 Spatial distribution of GAs in an Arabidopsis thaliana leaf[10] a-c.contents of (a)GA4,(b)GA8 and (c)GA19 in different leaf disc (position was marked in Fig.3d)of a Arabidopsis thaliana leaf;d.spatial distribution of GA19 within a single Arabidopsis thaliana leaf.

圖4 長(zhǎng)江流域不同省份甘藍(lán)型油菜籽中5種內(nèi)源性油菜素甾醇的地域分布[15]Fig.4 Geographical distribution of five endogenous BRs of Brassica napus L.oilseed rape originated from different provinces in Yangtze River basin[15]

多種類植物激素的時(shí)空分布研究:目前大多數(shù)時(shí)空分布研究尤其是空間分布研究仍集中在單一種類的植物激素,為獲得更全面的激素“地圖”信息,有必要開(kāi)發(fā)同時(shí)測(cè)定多種類植物激素的分析方法,實(shí)現(xiàn)多種類植物激素的時(shí)空分布測(cè)定。

無(wú)損、原位植物激素分析方法:在活體植物上進(jìn)行無(wú)損、原位植物激素分析可以避免取樣、樣品前處理帶來(lái)的不確定因素,獲得最直接的激素含量和分布數(shù)據(jù)。目前,任何一種成像技術(shù)都無(wú)法完全滿足植物激素時(shí)空分布研究的需求,質(zhì)譜成像、光學(xué)成像具有良好的發(fā)展前景;一些原位、活體前處理方法也具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

低等植物中植物激素的時(shí)空分布研究:伴隨著植物激素測(cè)定方法的不斷發(fā)展,植物學(xué)家對(duì)植物激素生理作用的關(guān)注已從陸生高等植物逐漸擴(kuò)展到低等植物,如微藻[38]等;目前,對(duì)低等植物中植物激素的研究報(bào)道遠(yuǎn)少于高等植物,低等植物中多種類激素的協(xié)同作用及時(shí)空分布情況才剛起步,植物激素在低等植物與高等植物中的含量與作用差異有助于植物進(jìn)化學(xué)的研究。

總而言之,原位、實(shí)時(shí)、高分辨、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)植物體內(nèi)的痕量植物激素仍是非常具有挑戰(zhàn)性的研究課題,也給分析科學(xué)的發(fā)展提供了較多機(jī)會(huì)。