2型糖尿病臨床血清樣本的內(nèi)源性多肽定量組學(xué)分析

牛 歡,張紅燕,彭佳喜,王 莉,趙興云,周孝禹,萬(wàn)麗紅,吳仁安*

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所,遼寧 大連 116023;2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

糖尿病是一種由多種因素引起糖代謝穩(wěn)定功能受損而致高血糖為主要特征的全身性代謝紊亂綜合征,患者高血糖的形成與肝臟、胰臟、腸道、脂肪肌肉組織、腎臟、腦等多臟器的功能失調(diào)相關(guān),已成為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的全球性流行的多發(fā)疾病[1,2]。血糖控制的失穩(wěn)可導(dǎo)致多種糖尿病并發(fā)癥,如:并發(fā)心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜及神經(jīng)系統(tǒng)的慢性病變和各種感染,嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生酮癥酸中毒等,甚至導(dǎo)致殘疾或死亡[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)已成為全球糖尿病第一大國(guó),目前糖尿病人數(shù)已超過(guò)1億,其中,1型糖尿病主要由自身免疫系統(tǒng)損害所致,約占糖尿病患者總數(shù)的5%;2型糖尿病(T2D)主要以胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損為特點(diǎn),患者數(shù)約占糖尿病患者總數(shù)的90%[4]。糖尿病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療對(duì)于病情的延緩和控制至關(guān)重要。在分子水平上呈現(xiàn)、跟蹤糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的變化分子譜圖,對(duì)糖尿病臨床診斷、分子分型及病理過(guò)程的理解可提供更加全面的數(shù)據(jù)支持。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,組學(xué)分析技術(shù)已發(fā)現(xiàn)部分蛋白質(zhì)、糖、脂質(zhì)、代謝物等生物分子在糖尿病中異常表達(dá),可以作為糖尿病的潛在分子標(biāo)志物[5-8]。內(nèi)源性多肽是相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa的多肽或蛋白質(zhì)水解片段,是細(xì)胞合成、調(diào)控等過(guò)程的重要內(nèi)源性生物分子,能夠反映機(jī)體基因表達(dá)的變化,也能引起相應(yīng)新陳代謝活動(dòng)的改變[9-11]。多肽組學(xué)作為一門(mén)系統(tǒng)性、全面性研究?jī)?nèi)源性多肽結(jié)構(gòu)、功能及變化規(guī)律的學(xué)科,是蛋白質(zhì)組學(xué)的重要補(bǔ)充,也是目前的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[12-15]。血清中含有豐富的內(nèi)源性多肽,可實(shí)時(shí)反映人體生理、病理狀態(tài)的變化和特性,被認(rèn)為是最有價(jià)值的生物標(biāo)本之一。血清內(nèi)源性多肽組的研究對(duì)于疾病標(biāo)志物的篩選、早期診斷、疾病動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及治療具有重要的臨床意義,已受到研究者的廣泛關(guān)注[16-18]。針對(duì)白血病,有研究者采用弱陽(yáng)離子交換磁珠對(duì)血清內(nèi)源性多肽進(jìn)行純化并結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定技術(shù),對(duì)比分析了急性淋巴細(xì)胞白血病患者和健康對(duì)照者血清樣本的內(nèi)源性多肽組,篩選出33條差異多肽[19]。此外,葡萄膜黑色素瘤[20]、兒童自閉癥[21]及膿毒癥[22]等多種疾病研究中也通過(guò)多肽組學(xué)技術(shù)鑒定到潛在的血清內(nèi)源性多肽標(biāo)志物。針對(duì)2型糖尿病,Wang等[23]通過(guò)對(duì)糖尿病患者和健康對(duì)照者血清樣本的內(nèi)源性多肽組的分析,鑒定到6條差異多肽,可作為診斷2型糖尿病的潛在多肽標(biāo)志物。在臨床樣品分析的多肽組學(xué)技術(shù)中所使用的MALDI-TOF-MS定性定量分析準(zhǔn)確性往往較差,而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)能夠提供較為穩(wěn)定、精確的多肽定性定量結(jié)果。本工作應(yīng)用低濃度乙腈輔助超濾聯(lián)合LC-MS/MS的定量多肽組學(xué)技術(shù),對(duì)臨床上健康組、糖尿病前期組及2型糖尿病組的血清樣本的內(nèi)源性多肽組進(jìn)行對(duì)比分析,篩選識(shí)別糖尿病發(fā)展過(guò)程中的差異內(nèi)源性多肽,旨在尋找2型糖尿病早期診斷及分子分型的多肽分子標(biāo)志物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與材料

截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa的離心超濾管購(gòu)于Millipore公司(美國(guó));甲酸(formic acid,FA)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó));23例人血清樣品(包括7例健康者血清樣本、7例糖尿病前期患者血清樣本和9例2型糖尿病患者血清樣本)來(lái)自上海第六人民醫(yī)院。實(shí)驗(yàn)用的乙腈為色譜純(Merck公司),實(shí)驗(yàn)用水全部經(jīng)Milli-Q(Millipore,美國(guó))處理。

1.2 樣本的采集與預(yù)處理

血液樣品采集后保存于-80 ℃冰箱。糖尿病前期患者和2型糖尿病患者由專(zhuān)家確診或排除,3組受試人群的年齡、體重指數(shù)(BMI)、血糖等指標(biāo)均相匹配。血液樣品獲得當(dāng)?shù)蒯t(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有受試者都簽署知情同意書(shū)。樣本臨床信息見(jiàn)表1。

血清內(nèi)源性多肽的提取采用低濃度乙腈輔助超濾離心法。具體操作流程如下:從-80 ℃冰箱中取出血樣并在冰浴中解凍,渦旋混勻,20 000 g離心5 min,棄去脂質(zhì)。每例血清樣本取25 μL于1.5 mL離心管中,加入125 μL去離子水稀釋并煮沸變性5 min。待溫度冷至室溫后,加入150 μL 40% ACN(含0.1% FA)溶液使乙腈終體積分?jǐn)?shù)為20%,渦旋混勻并于冰浴中靜置40 min。然后將樣品轉(zhuǎn)移到截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 kDa超濾管中,在6 000 g、4 ℃條件下離心20 min,并用300 μL 20% ACN(含0.1% FA)溶液清洗濾餅兩次。收集濾液,冷凍干燥,經(jīng)C18 SPE柱除鹽后,儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中備用。進(jìn)樣分析前,樣品復(fù)溶到25 μL 0.1% FA溶液中,渦旋混勻2 min,在20 000 g、4 ℃條件下離心5 min,取上清液置于進(jìn)樣瓶中用于nano-LC-MS/MS分析。

表1 血液樣本的臨床信息Table1 Clinical information of blood samples

1.3 LC-MS/MS分析

LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集由nano-RPLC-MS/MS系統(tǒng)完成。該系統(tǒng)由四元梯度泵的高效液相色譜(Ultimate 3000)、自動(dòng)進(jìn)樣器和線性離子阱-靜態(tài)軌道阱(LTQ-Orbitrap Elite)組成,采用3 cm長(zhǎng)的C18預(yù)柱(200 μm i.d.)輔助自動(dòng)進(jìn)樣,樣品首先保留到預(yù)柱上,然后經(jīng)梯度洗脫到分析柱上(150 μm i.d.,14 cm)進(jìn)行分離,質(zhì)譜鑒定。

液相色譜流動(dòng)相組成:A相為0.1%的FA水溶液,B相為80% ACN(含0.1% FA)溶液。分離梯度設(shè)為:0～10 min,2%B;10～13 min,2%B～5%B;13～73 min,5%B～28%B;73～88 min,28%B～45%B;88～89 min,45%B～95%B;89～94 min,95%B;94～95 min,95%B～2%B;95～105 min,2%B。流動(dòng)相流速為0.5 μL/min。

質(zhì)譜條件:LTQ離子傳輸管的溫度設(shè)為275 ℃,電噴霧電壓設(shè)為2.7 kV。所有的數(shù)據(jù)采集模式均為數(shù)據(jù)依賴(lài)模式(data-dependent mode,DDA),質(zhì)譜全掃描在Orbitrap中采集,掃描范圍為200～2 000 Da,分辨率設(shè)為12 000。二級(jí)質(zhì)譜掃描在LTQ中采集,采用碰撞誘導(dǎo)解離(CID)碎裂方式。利用Xcalibur軟件(version 2.1,Thermo公司)進(jìn)行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索分析

LTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀所采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)利用Mascot(Version 2.6.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)檢索,檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為人源庫(kù)(UniProt,約17萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì))。檢索參數(shù)設(shè)為:甲硫氨酸殘基(+15.994 9 Da)為可變修飾,無(wú)酶切,母離子質(zhì)量誤差為20 ppm,二級(jí)碎片離子誤差為0.8 Da。多肽篩選門(mén)檻設(shè)定如下:得分值高于20,假陽(yáng)性率(FDR)小于1%。多肽定量采用MaxQuant軟件(http://maxquant.org/,version 1.6.1.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。假陽(yáng)性率(false discovery rate,FDR)為0.01。

1.5 生物信息學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將MaxQuant軟件所得的肽段信號(hào)強(qiáng)度導(dǎo)入Perseus軟件進(jìn)行過(guò)濾無(wú)效值、對(duì)數(shù)變換、正態(tài)分布以及缺失值補(bǔ)齊等數(shù)據(jù)前處理。采用悟空平臺(tái)(https://www.omicsolution.org/wu-kong-beta-linux/main/)構(gòu)建PLS-DA模型及非參數(shù)檢驗(yàn)。使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Panther和String分別對(duì)差異肽段匹配的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法評(píng)價(jià)與表型區(qū)分

采用超濾法提取血清內(nèi)源性多肽時(shí),多肽與蛋白質(zhì)的結(jié)合以及超濾膜的吸附作用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的多肽損失。為此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)超濾法提取血清內(nèi)源性多肽過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化,以低濃度乙腈處理超濾管中被截留的蛋白質(zhì)組分,改善了多肽回收率。標(biāo)準(zhǔn)多肽回收率測(cè)試表明,無(wú)低濃度乙腈處理的直接超濾法中,強(qiáng)疏水性多肽(AINVAVHVF、VLDAVRGSPAINVAVHVF、NVHSAGAAGSRMNFRPGVLS)無(wú)法被檢測(cè)到,弱疏水性和親水性多肽(ATASRGASQAGAPQGR、SSKITHR、RHDWGHEKQ)的回收率均低于40%。而經(jīng)低濃度乙腈處理后,弱疏水性和親水性多肽的回收率均提高至90%以上,強(qiáng)疏水性多肽被質(zhì)譜成功鑒定,回收率也可達(dá)約30%～50%。進(jìn)一步將該方法用于血清內(nèi)源性多肽的提取中,通過(guò)LC-MS/MS可從5 μL健康人血清中鑒定到868條內(nèi)源性多肽,3針重復(fù)可鑒定到598條內(nèi)源性多肽,是血清直接超濾鑒定數(shù)量的2倍,顯示了低濃度乙腈輔助超濾在實(shí)際樣本多肽組深度鑒定中的有效性與可靠性。由此,建立了低濃度乙腈輔助超濾法結(jié)合LC-MS/MS的多肽組學(xué)分析方法,用于糖尿病3個(gè)發(fā)展階段的血清內(nèi)源性多肽組的分析鑒定。根據(jù)Mascot檢索結(jié)果及MaxQuant定量結(jié)果,認(rèn)為至少一組中有60%以上樣本鑒定到的肽段為可靠肽段。對(duì)23例血清樣本所鑒定的unique peptide取并集,共鑒定到690條可靠血清內(nèi)源性肽段。構(gòu)建PLS-DA模型,將實(shí)際樣品投影到兩個(gè)主成分組成的二維平面上(見(jiàn)圖1),對(duì)照組(N組)、糖尿病前期組(preT2D組)和2型糖尿病組(T2D組)之間有明顯的分離趨勢(shì),表明3類(lèi)樣本在多肽水平上具有顯著性差異。

圖1 3組樣品間構(gòu)建的PLS-DA模型散點(diǎn)圖Fig.1 Partial least squares-discriminant analysis(PLS-DA)score plots for the three groups

2.2 篩選血清內(nèi)源性差異多肽

2.2.1僅在preT2D組表達(dá)和僅在T2D組表達(dá)的血清內(nèi)源性多肽

對(duì)這690條可靠肽段進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)有39條內(nèi)源性多肽(對(duì)應(yīng)23個(gè)蛋白質(zhì))僅在preT2D組中被鑒定(表2,上標(biāo)為a的肽段),有97條內(nèi)源性多肽(對(duì)應(yīng)43個(gè)蛋白質(zhì))僅在T2D組中被檢測(cè)(表2,上標(biāo)為b的肽段)。

表2 差異多肽及匹配蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息列表Table2 Detailed information of differential peptides and matched proteins

表2 (續(xù))Table2 (Continued)

表2 (續(xù))Table2 (Continued)

表2 (續(xù))Table2 (Continued)

a:endogenous peptides detected only in preT2D group;b:endogenous peptides detected only in T2D group;-:not significantly changed peptide compared with the normal group.

2.2.2ANOVA方差分析尋找3組間顯著性變化的內(nèi)源性多肽

對(duì)3組均鑒定到的內(nèi)源性多肽(376條)進(jìn)行ANOVA方差分析(p-value<0.05,fold change>2),發(fā)現(xiàn)3組間有27條顯著性變化多肽。

對(duì)這27條差異多肽做聚類(lèi)分析并對(duì)每個(gè)聚類(lèi)部分的差異多肽在3組中的強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)圖2),結(jié)果顯示這些差異肽段主要聚類(lèi)為4部分(以N組作為參考),包括在T2D組顯著性變化的肽段(圖2a:下調(diào)4條肽段,上調(diào)9條肽段)、在preT2D組顯著性變化的肽段(圖2b:下調(diào)3條肽段,上調(diào)2條肽段)、在preT2D組和T2D組同時(shí)顯著性變化的肽段(圖2c:1條下調(diào)和5條上調(diào)的肽段)以及3條在preT2D組上調(diào)而在T2D組下調(diào)的肽段(圖2d)。

將2.2.1節(jié)和2.2.2節(jié)所得的差異多肽進(jìn)行匯總,共篩選出163條差異多肽(匹配56個(gè)蛋白質(zhì)),作為進(jìn)一步研究糖尿病標(biāo)志物的候選集。它們的詳細(xì)信息(包括肽段序列、匹配的蛋白質(zhì)信息以及它們?cè)趐reT2D組和T2D組的變化趨勢(shì))見(jiàn)表2。

圖2 3組間顯著性變化多肽的強(qiáng)度Fig.2 Intensities of the significantly changed peptides among the three groups a.Cluster that the peptide contents are significantly different (p-value<0.05,fold change>2)only in the type 2 diabetes (T2D)group;b.cluster that the peptide contents are significantly different only in the preT2D group.c.cluster that the peptides are up-regulated or down-regulated in both preT2D and T2D groups;d.cluster that the peptides are up-regulated in the preT2D group but down-regulated in the T2D group.

2.3 血清內(nèi)源性差異多肽所匹配蛋白質(zhì)的生物學(xué)分析

2.3.1GO功能分析

對(duì)這些差異多肽所匹配的蛋白質(zhì)通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)Panther進(jìn)行功能注釋分析(見(jiàn)圖3)。結(jié)果表明這些蛋白質(zhì)的功能類(lèi)別主要涉及分子水平的結(jié)合、催化、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié),其中結(jié)合功能占主導(dǎo)地位;它們多數(shù)位于細(xì)胞外,也有一部分位于細(xì)胞膜以及組織中;所參與的生物學(xué)過(guò)程主要為代謝、應(yīng)激、生物黏附、免疫系統(tǒng)、生物調(diào)節(jié)等過(guò)程。

圖3 差異多肽所匹配蛋白質(zhì)的GO分析Fig.3 Gene ontology analysis of the differential peptide matched proteins a.molecular function analysis;b.cellular component analysis;c.biological process analysis.

圖4 差異多肽匹配蛋白質(zhì)的KEGG信號(hào)通路分析Fig.4 KEGG signal pathway of differential peptide matched proteins

2.3.2KEGG信號(hào)通路分析

將差異蛋白質(zhì)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫(kù)String中進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析,結(jié)果顯示這些蛋白質(zhì)主要富集在補(bǔ)體(complement cascade)和凝血(coagulation cascade)通路中,共涉及14個(gè)蛋白質(zhì)(見(jiàn)圖4)。此外,還有4個(gè)蛋白質(zhì)(APOA1、APOA4、APOC3、APOE)富集在膽固醇代謝(cholesterol metabolism)通路中。補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,通過(guò)經(jīng)典途徑、旁路途徑及凝集素途徑被激活,主要介導(dǎo)免疫和炎癥過(guò)程。補(bǔ)體系統(tǒng)的激活也與胰島素抵抗存在潛在聯(lián)系,可能與2型糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)[24,25]。凝血系統(tǒng)在機(jī)體中也發(fā)揮著重要的作用,尤其是在抵抗感染和維持機(jī)體止血方面。糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程也涉及凝血系統(tǒng)的激活,研究發(fā)現(xiàn)高血糖可以通過(guò)加劇葡萄糖氧化和使線粒體產(chǎn)生活性氧成分而增加氧化應(yīng)激,損傷血管內(nèi)膜使病人處于凝血、纖溶等血液病理狀態(tài)[26,27]。糖尿病患者長(zhǎng)期高凝血狀態(tài)還是其發(fā)生心血管疾病腦卒中和栓塞的高風(fēng)險(xiǎn)因素[28,29]。另外,血脂代謝的異常也被報(bào)道為2型糖尿病高風(fēng)險(xiǎn)因素以及病理表現(xiàn)特點(diǎn)之一,可以作為糖尿病早期篩查和診斷以及預(yù)測(cè)糖尿病患者脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)并發(fā)癥的早期指標(biāo)[30]。

除此之外,還有包括S100-A8蛋白、凝溶膠蛋白、叢生蛋白、結(jié)合珠蛋白、組蛋白H2B型F-S、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3、胸腺素β4、α2-HS-糖蛋白、甲狀腺素轉(zhuǎn)鐵蛋白等蛋白質(zhì)可能也參與了2型糖尿病的病理過(guò)程。S100-A8蛋白、凝溶膠蛋白主要介導(dǎo)炎癥過(guò)程,與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[31-35]。叢生蛋白和結(jié)合珠蛋白被報(bào)道與糖尿病眼病、腎病等并發(fā)癥有關(guān)[36-39]。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3是一種癌癥風(fēng)險(xiǎn)的保護(hù)劑,是評(píng)估癌癥風(fēng)險(xiǎn)的重要因子,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,也與糖尿病相關(guān)[40-42]。胸腺素β4具有多重生物學(xué)功能,在組織再生、重塑、創(chuàng)傷愈合、維持肌動(dòng)蛋白平衡、腫瘤發(fā)病與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、炎癥、血管生成、毛囊發(fā)育等生理、病理過(guò)程中扮演著極為重要的角色,也可能參與糖尿病病理過(guò)程[43]。α2-HS-糖蛋白是先天免疫Toll-like受體(TLR)-4,也可以與胰島素受體β亞單位相結(jié)合來(lái)阻止胰島素受體酪氨酸激酶調(diào)節(jié)胰島素信號(hào),從而出現(xiàn)胰島素抵抗,與T2D的發(fā)病關(guān)系密切[44]。

3 小結(jié)

綜上所述,通過(guò)對(duì)2型糖尿病3個(gè)不同發(fā)展階段的血清樣本內(nèi)源性多肽組的定性定量分析,從正常組、糖尿病前期組及2型糖尿病組樣品中篩選出163條差異內(nèi)源性多肽,為2型糖尿病早期篩查、早期診斷及分子分型等生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了可能。