乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用分析

黃紅連

(深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055)

眾所周知，乙型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎是全世界范圍內(nèi)所重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一，且有相關(guān)研究報(bào)道顯示，截止2008年，全球慢性乙型肝炎病毒感染患者約有4億人，其中約有25%的患者會(huì)進(jìn)展成為肝硬化或肝細(xì)胞癌[1]。迄今為止，臨床上主要采用核苷酸類(lèi)似物以及干擾素等藥物進(jìn)行抗乙型肝炎病毒治療[2，3]。且近年來(lái)恩替卡韋以及阿德福韋酯等新型藥物開(kāi)始被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，具有抗乙型肝炎病毒效果更明顯，耐藥率更低的優(yōu)勢(shì)。然而，上述藥物無(wú)法清除肝細(xì)胞核中的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，因此無(wú)法徹底治愈乙型肝炎病毒感染[4]。由此，對(duì)乙型肝炎病毒感染的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入的研究，從而尋找治療乙型肝炎病毒感染的新手段是臨床肝病專(zhuān)家們關(guān)注的重點(diǎn)。其中，NK細(xì)胞屬于天然免疫系統(tǒng)中重要細(xì)胞之一，主要是通過(guò)分泌細(xì)胞因子以及特異性殺傷病毒感染的細(xì)胞，從而起到抗病毒作用[5]。鑒于此，本文通過(guò)研究乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用，旨在為臨床乙型肝炎病毒感染的治療提供指導(dǎo)作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 研究材料 HepG2．2．15細(xì)胞來(lái)自荷蘭鹿特丹伊拉斯慕斯醫(yī)學(xué)院胃腸病肝病部實(shí)驗(yàn)室；流式細(xì)胞儀FACS CantoⅡ以及細(xì)胞分選儀FACS-Aria均購(gòu)自美國(guó)BD公司；IFNγ特異性酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；NK細(xì)胞分離試劑盒購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；過(guò)濾儀Centricon Plus-70購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1．2 研究方法 ⑴乙型肝炎病毒獲取：采用10%胎牛血清以及1%請(qǐng)鏈霉素的培養(yǎng)液對(duì)HepG2．2．15細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。采集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞上清液，采用過(guò)濾器進(jìn)行分離純化乙型肝炎病毒，并通過(guò)PCR技術(shù)定量測(cè)定病毒量。⑵外周血pDC與NK細(xì)胞的提?。菏紫韧ㄟ^(guò)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法對(duì)研究對(duì)象的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行提取，同時(shí)以藻紅蛋白抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4單克隆抗體對(duì)PBMC進(jìn)行標(biāo)記，洗滌后進(jìn)行抗PE磁株標(biāo)記。隨后采用磁株陽(yáng)性分選法對(duì)PBMC中的抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分離，以FACS-Aria分選儀獲取高純度的抗血液樹(shù)突狀細(xì)胞抗原4陽(yáng)性細(xì)胞，即純度＞99%的外周血pDC。NK細(xì)胞分離時(shí)機(jī)和通過(guò)陰性選擇的方式提取外周血NK細(xì)胞，并采用流式雙染色法測(cè)定NK細(xì)胞純度。⑶NK細(xì)胞分泌的IFNγ量測(cè)量：對(duì)健康對(duì)照組的外周血NK細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，同時(shí)加入10ng/ml的白細(xì)胞介素12（IL-12）以及IL-18進(jìn)行刺激。將外周血來(lái)源的NK細(xì)胞和來(lái)自同一研究對(duì)象的外周血pDC按照5：1的比例共同放置于96孔板中，以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。時(shí)候分別加入4×106/ml的乙型肝炎病毒、10μg/ml的CpG寡脫氧核酸以及皰疹病毒進(jìn)行刺激。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒與Model 680微板讀數(shù)儀，測(cè)量450nm處的吸光度，計(jì)算IFNγ的含量。⑷NK細(xì)胞內(nèi)IFNγ的測(cè)量：采用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法進(jìn)行測(cè)定，即在培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌，標(biāo)記細(xì)胞表面抗體，經(jīng)由2%的中性加權(quán)固定20min后標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的抗體，再次對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。⑸NK細(xì)胞殺傷毒性檢測(cè)：將NK細(xì)胞與熒光標(biāo)記的K562細(xì)胞共同溫育4h，待細(xì)胞洗滌后，加入7-氨基放線菌素D進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，并根據(jù)7-氨基放線菌素D以及細(xì)胞熒光雙養(yǎng)性進(jìn)行K562細(xì)胞死亡情況的評(píng)估。

1．3 觀察指標(biāo) 分析乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 20．0軟件進(jìn)行檢測(cè)分析，采用“χ2”檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，用“[n(%)]”表示計(jì)數(shù)資料，用“（x±s）”表示計(jì)量資料均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差。P值＜0．05為兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響純化NK細(xì)胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞分泌IFNγ量比較不明顯，組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。見(jiàn)表 1。

表1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

表1 乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

組別純化NK細(xì)胞IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞t值P值例數(shù) IFNγ 水平（ng/ml）120 120--9．92±1．35 10．15±1．38 1．305 0．193

2．2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響 CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量，而單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量，組間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。 見(jiàn)表2。

表2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

表2 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ的影響

注：與乙型肝炎病毒刺激相比，#P＜0．05；與單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞相比，*P＜0．05。

組別單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞CpG寡脫氧核酸刺激皰疹病毒刺激乙型肝炎病毒刺激例數(shù) IFNγ 水平（ng/ml）120 120 120 120 0．43±0．04#1．22±0．42#*1．34±0．41#*0．21±0．01

2．3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響 pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率均明顯高于純化NK細(xì)胞，組間對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0．05）；而 pDC 誘導(dǎo)的NK細(xì)胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率相比不明顯，組間對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。 見(jiàn)表 3。

表3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響

表3 乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞K562的影響

注：與純化 NK 細(xì)胞相比，*P＜0．05。

組別純化NK細(xì)胞pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞例數(shù) 靶細(xì)胞K562死亡率（%）120 120 120 38．54±3．25 71．52±4．31*70．87±4．28*

3 討論

近年來(lái)，隨著相關(guān)研究的逐漸深入，越來(lái)越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒的發(fā)展與臨床轉(zhuǎn)歸均和機(jī)體內(nèi)的抗病毒免疫應(yīng)答存在密切相關(guān)[6-8]。其中NK細(xì)胞是有異于T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的一種具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的特殊淋巴細(xì)胞系，具有明顯的抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等作用[9-11]。其主要來(lái)源于骨髓，并在體內(nèi)所有淋巴細(xì)胞中占比約為5%～10%。有研究報(bào)道顯示[12-14]，NK細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用并不需要特異性抗原的刺激，其中靶細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、免疫復(fù)合物以及其他細(xì)胞因子均可直接誘發(fā)NK細(xì)胞的免疫反應(yīng)，并在短時(shí)間內(nèi)達(dá)至高峰。NK細(xì)胞分泌的最重要細(xì)胞因子為IFNγ，其對(duì)病毒的復(fù)制具有明顯的抑制作用，且在Th1細(xì)胞應(yīng)答和T淋巴細(xì)胞毒性反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要作用[15-17]。由此，本文通過(guò)研究乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞免疫活性的影響作用，以期為臨床乙型肝炎病毒感染的防治提供理論依據(jù)。

本文結(jié)果顯示：純化NK細(xì)胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細(xì)胞分泌IFNγ量比較不明顯，這表明了乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞分泌IFNγ量無(wú)明顯影響。然而，CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量，而單純pDC誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量，這又提示了乙型肝炎病毒對(duì)pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞分泌IFNγ量具有明顯的抑制作用。分析原因，筆者認(rèn)為可能是乙型肝炎病毒通過(guò)和細(xì)胞接觸或分泌可溶性因子的途徑，進(jìn)一步發(fā)揮干擾NK細(xì)胞功能的作用，而不是通過(guò)進(jìn)入NK細(xì)胞內(nèi)的途徑影響其功能。此外，pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率均明顯高于純化NK細(xì)胞，而pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細(xì)胞組的靶細(xì)胞K562死亡率相比不明顯，這表明了純化的NK細(xì)胞對(duì)562靶細(xì)胞的殺傷活性較低，而在與pDC共同培養(yǎng)時(shí)，其對(duì)562靶細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)，且乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞的殺傷毒性無(wú)明顯影響作用。另外，除了乙型肝炎病毒以外，還有一些病毒同樣具有抑制pDC對(duì)NK細(xì)胞的免疫誘導(dǎo)作用。其中HIV病毒可通過(guò)抑制pDC活化的NK細(xì)胞IFNγ分泌水平，而這一機(jī)制可能在其感染后的致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[18，19]。另有研究報(bào)道顯示，人巨細(xì)胞病毒感染的pDC對(duì)NK細(xì)胞的殺傷活性無(wú)誘導(dǎo)作用[20，21]。

綜上所述，乙型肝炎病毒對(duì)NK細(xì)胞的活性無(wú)激活作用，且會(huì)對(duì)pDC誘導(dǎo)活化NK細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，從而促進(jìn)乙型肝炎病毒在機(jī)體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制，提高患者發(fā)生持續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。值得臨床重點(diǎn)關(guān)注。