CYP2C19基因多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓的關(guān)聯(lián)研究

武子舉

(平頂山市第二人民醫(yī)院心內(nèi)一科，河南 平頂山467000)

慢性心力衰竭是臨床中一種常見病，病因包括高血壓性心臟病、瓣膜病和冠心病等[1-4]。而左心衰是引起肺動脈高壓的常見病因[1]。相關(guān)研究顯示，近2/3的心力衰竭患者可能合并肺動脈高壓[2]。而心力衰竭患者一旦合并肺動脈高壓，其死亡風(fēng)險(xiǎn)會顯著增加[3，4]。因此，如何提高心力衰竭合并肺動脈高壓患者的診斷也就顯得尤為必要。CYP2C19基因編碼細(xì)胞色素P450超家族酶的成員[5]。細(xì)胞色素P450蛋白是單加氧酶，其催化許多涉及藥物代謝和膽固醇，類固醇和其他脂質(zhì)合成的反應(yīng)，這種蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)[6]。之前有研究表明，CYP2C19等位基因功能缺失與不良的心血管事件明顯相關(guān)[7-9]。此次研究為了探究CYP2C19基因多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓患者的相關(guān)性，我們院于2014年6月至2016年6月期間收治了50例心力衰竭合并肺動脈高壓患者以及招募等數(shù)量健康人群，分析CYP2C19 rs12248560基因多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓患者的關(guān)聯(lián)，結(jié)果如下：

1 材料與方法

1．1 一般資料 我院于 2014年6月至 2016年6月期間收治了50例心力衰竭合并肺動脈高壓患者以及等數(shù)量健康人群的外周血樣本，其中心力衰竭合并肺動脈高壓病患者中有男性30例，女性20例，年齡范圍為14歲至43歲，平均年齡為（37．5±5．3）歲；正常人群組男性 32 例，女性 18 例，年齡范圍為 13 歲至 45 歲，平均年齡為（38．6±5．1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有患者均經(jīng)心臟彩超檢查，診斷為慢性心力衰竭合并肺動脈高壓；2）肺動脈高壓為輕、中度者；3）患者未接受鈣離子拮抗劑、前列環(huán)素類藥物的治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他原因引起的肺動脈高壓，原發(fā)性肺動脈高壓，肺動脈高壓重度者，使用氯吡格雷以外的抗血小板藥，抗凝血劑或奧美拉唑作為質(zhì)子泵抑制劑，血小板計(jì)數(shù)為低于150000/mm3，血細(xì)胞比容值＜33%或血清肌酐值＞2．5mg/dl。該研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，且招募患者及健康志愿者均在知情同意書簽字。兩組患者的一般臨床資料如性別、年齡、病程等無明顯差異（P＞0．05），結(jié)果具有可比性。

1．2 研究方法

1．2．1 DNA提取 在所有樣本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1．2．2 引物合成 CYP2C19基因上游和下游的引物合成序列見表1，引物由上海烈冰生物技術(shù)有限公司合成。

1．2．3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增 預(yù)變性 95°C 4min、變性 95°C 30s、退火 56°C 30s， 延伸 72°C 30s，72°C 末延伸 5min；共35個循環(huán)；酶切體系及條件：10X FastDigest Gren Bufer 2μl，F(xiàn)astDigestenzyme 1μl(rs11615 使 用Eam1105I，rs13181 使用 AleI)，ddH2O 17μl，PCR 產(chǎn)物 10μl；水浴 37°C 酶切 10min，然后取出立即置水浴65°C滅活5min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45min，電壓設(shè)置為145V。

表1 基因引物設(shè)計(jì)

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用padgragh 6．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg遺傳平衡定律和兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0．05。

2 結(jié)果

2．1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) CYP2C19 rs12248560的CC、CT、TT基因型在對照組組數(shù)目分別為 34、12、4， 符合 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)（χ2=0．12，P=0．94）。

2．2 CYP2C19 rs12248560基因型和等位基因頻率在心力衰竭合并肺動脈高壓患者組與健康對照組的分布 由表2結(jié)果表明，CYP2C19 rs12248560基因多態(tài)性均存在3種基因型，對各基因的3種基因型分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)CYP2C19 rs12248560 的基因型分布有顯著差異（χ2=7．15，P=0．027）。 CYP2C19 rs12248560 的 C、T 等位基因在心力衰竭合并肺動脈高壓患者組的分布頻率分別為65%、35%；在正常對照組的分布頻率分別為76%、24%；兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5．36，P=0．024）。 見表 3。

表2 CYP2C19 rs12248560基因型頻率分布[n(%)]

表3 CYP2C19 rs12248560等位基因頻率分布[n(%)]

2．3 CYP2C19 rs12248560多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)生的關(guān)系 分析CYP2C19 rs12248560基因的基因型與心力衰竭合并肺動脈高壓的關(guān)系時發(fā)現(xiàn)CYP2C19的T（突變型）等位基因與C（野生型）等位基因比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=6．35，P=0．049）。見表 4。

表4 CYP2C19 rs12248560基因多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓的關(guān)系[n(%)]

2．4 PCR擴(kuò)增 對CYP2C19 rs12248560位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型三種基因型和樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂變性凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相同，在91bp附近，每孔只有一條亮帶，條帶清洗無雜帶，PCR擴(kuò)增特異性好。見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

3 討論

冠心病、高血壓和瓣膜病患者均可能會出現(xiàn)慢性心力衰竭，其中左心衰竭最為常見[10]。左心衰竭會造成肺動脈壓升高，不僅能引起左室收縮功能受損，而且能引起左室舒張功能受損；而左室舒張功能受損則引起右室收縮壓升高，進(jìn)一步造成肺動脈壓升高[11]。此外，左室舒張功能受損還會引起心室肌主動舒緩延遲，減少肺靜脈流入左心房的血流量，從而加大左心房的代償性收縮，造成逆向進(jìn)入肺靜脈的血流增加，進(jìn)一步升高肺動脈壓。心力衰竭一旦合并肺動脈高壓，其死亡率會顯著升高[12]。為進(jìn)一步提高對心力衰竭合并肺動脈高壓的診斷，對后續(xù)治療提供可靠依據(jù)，最近利用基因組學(xué)的精準(zhǔn)治療的應(yīng)用越來越廣泛。

之前有研究表明外周血管內(nèi)皮功能障礙與CYP2C19變異體患者有關(guān)聯(lián)[13]。內(nèi)皮功能在維持血管張力，血栓形成，血小板粘附和血管系統(tǒng)血細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用，內(nèi)皮功能受損反映早期動脈粥樣硬化改變[14]。動脈粥樣硬化改變引起慢性炎癥[15]，包括將血小板募集到內(nèi)皮損傷部位，導(dǎo)致血小板活性的激活，最近報(bào)道內(nèi)皮功能障礙與高血小板反應(yīng)性獨(dú)立相關(guān)[16]。因此，內(nèi)皮功能障礙可能對更高的血小板反應(yīng)性具有累加效應(yīng)，導(dǎo)致更多的載體中的心血管事件[17]。另外，已有研究報(bào)道奧美拉唑作為一種強(qiáng)效的CYP2C19抑制劑，經(jīng)常用于肺動脈高壓患者的治療，已經(jīng)顯示奧美拉唑的合用會增加經(jīng)CYP2C19氧化代謝的藥物的血漿濃度[18]。

本次研究的結(jié)果顯示，CYP2C19 rs12248560基因型與等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且CYP2C19 rs12248560 T/T基因型和T等位基因與心力衰竭合并肺動脈高壓顯著相關(guān)，說明了CYP2C19 rs12248560基因多態(tài)性在心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)生過程中是危險(xiǎn)因素。本研究中雖然分析了CYP2C19的基因型、等位基因與心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)展的關(guān)系，但由于樣本量局限，在后續(xù)研究中需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量。遺傳多態(tài)性在很多復(fù)雜性疾病研究中被認(rèn)為發(fā)揮著重要作用。建立預(yù)測性生物標(biāo)記物用于早期評估心力衰竭合并肺動脈高壓是非常有必要的，通過檢測基因多態(tài)性的預(yù)處理識別能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生開展合理的治療，對穩(wěn)定患者病情非常有幫助。我們的研究提出了CYP2C19基因多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)生的關(guān)聯(lián)，并指出了CYP2C19 rs12248560 T/T、等位基因T能夠作為心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)生的危險(xiǎn)因素，可以作為早期預(yù)防心力衰竭合并肺動脈高壓的臨床標(biāo)記物。

綜上所述，CYP2C19多態(tài)性與心力衰竭合并肺動脈高壓發(fā)生顯著相關(guān)，檢測其多態(tài)性對早期發(fā)現(xiàn)心力衰竭合并肺動脈高壓有一定價值。