氣相色譜-質(zhì)譜法測定食用植物油中3-氯-1,2-丙二醇酯的不確定度評定

熊麗，周鴻

(江西省疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330029)

氯丙醇酯是近年來國際上較為關(guān)注的新型食品污染物，以精煉植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯（3-MCPD酯）污染最為顯著，其含量是游離態(tài)氯丙醇（3-MCPD）的上百甚至上千倍[1]。近年來毒理研究表明3-MCPD酯具有一定的毒性作用[2]，但對其健康的擔(dān)心主要是因?yàn)槁缺减?huì)在加熱、加酸、微生物或人體腸道胰脂酶的作用下水解成游離態(tài)的氯丙醇[3]，而游離氯丙醇（3-MCPD）是公認(rèn)的食品污染物，具有潛在的致癌性、神經(jīng)毒性、免疫毒性、遺傳毒性和生殖毒性[4]，會(huì)對人體健康構(gòu)成極大威脅。

不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測量的分散性。為了保障實(shí)驗(yàn)室提供的分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，及時(shí)分析與評定結(jié)果的不確定度具有十分重要的意義。本研究依據(jù)JJF 1059．1-2012《測量不確定度評定與表示》[5]，參照《2016年國家食品污染物和有害因素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作手冊》中《食品中脂肪酸氯丙醇酯含量的標(biāo)準(zhǔn)操作程序》及相關(guān)文獻(xiàn)[6-8]，采用氣相色譜-質(zhì)譜法，對食用植物油中3-氯-1，2-丙二醇酯測量結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評定，為進(jìn)一步探討測量結(jié)果的準(zhǔn)確程度和方法的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑 7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國Agilent公司；XP-205電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；SK8200HP超聲清洗器：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本ELELA公司；DHG-9101-3SA電熱恒溫箱：上海鴻都電子科技有限公司；氣密針（1．0ml）：瑞士hamilton公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯（3-MCPD 酯）、d5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯 （d5-3-MCPD酯）加拿大TRC公司。正己烷、甲醇、乙酸乙酯（色譜純）：德國Merk公司；甲基叔丁基醚（色譜純）：上海國藥沃凱；七氟丁?；溥颍喝毡綯CI公司；乙醚（分析純）：國藥集團(tuán)。硅藻土基質(zhì)固相分散萃取柱、高效脫水劑：福州勤鵬生物科技有限公司。

1．2 方法

1．2．1 色譜條件 DB-5MS毛細(xì)管色譜柱 （30m×0．25mm×0．25μm）：美國 Agilent公司；進(jìn)樣口溫度：280℃； 載氣： 高純氦氣 （純度≥99．999%）； 流速1．0ml/min；程序升溫：50℃保持 1min，再以 2℃/min的速度升至90℃，最后以40℃/min的速度升至280℃，保持5min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積：1．0μl。

1．2．2 質(zhì)譜條件 電離方式為電子轟擊源 （EI）；電離能量 70ev；溶劑延遲 3min；阱溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；監(jiān)測方式選擇離子掃描（SIM）；3-MCPD 衍生物定性離子 m/z為 253、289、453，其中253為定量離子；內(nèi)標(biāo)物d5-3-MCPD衍生物定性離子m/z為257、294、278，其中257為定量離子。

1．2．3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取 0．1g（精確至 1mg）食用植物油于50ml離心管中，加入100μl（濃度為2．0μg/ml） 的內(nèi)標(biāo)使用液， 加入 0．5ml甲基叔丁基醚/乙酸乙酯溶液，混勻，超聲；水解：加入 1．0ml甲醇鈉溶液水解后加入冰乙酸中和以終止水解；凈化：用硅藻土小柱（基質(zhì)分散固相萃取法）凈化，先以正己烷淋洗，再以無水乙醚洗脫，洗脫液充分脫水后轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，減壓濃縮至近干，用滴管將其轉(zhuǎn)入帶磨口塞的5ml玻璃刻度試管中，再用正己烷分兩次充分洗滌雞心瓶內(nèi)壁，合并洗滌液至約為 1．0ml；衍生：用氣密針加入 50μl七氟丁?；溥?（HFBI）后于 75℃的電熱恒溫箱中衍生30min；衍生結(jié)束后，取出冷卻至室溫，補(bǔ)加正己烷至體積為1．0ml，再入2ml飽和氯化鈉溶液，充分渦旋，放置后取上層有機(jī)相以無水硫酸鈉脫水后供氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣分析。

1．2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以0．10g飽和氯化鈉為本底，分別準(zhǔn)確移取 10、50、100、200、300μl 3-MCPD酯標(biāo)準(zhǔn)使用液 （濃度為2．0μg/ml） 于50ml離心管中， 分別相當(dāng)于 20、100、200、400、600ng的氯丙醇酯，以樣品為0．1g計(jì)算，相當(dāng)于氯丙醇酯濃度分別為 0．200、1．00、2．00、4．00、6．00mg/kg （均以氯丙醇計(jì)），再各加入內(nèi)標(biāo)工作液（2．0μg/ml）100μl，混勻，之后步驟同1．2．3樣品前處理。

1．2．5 樣品檢測與計(jì)算 以3-MCPD衍生物的峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積之比（Y）對3-MCPD酯的質(zhì)量（X，ng）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算氯丙醇酯的質(zhì)量，按下式計(jì)算食用植物油中3-MPCD酯的含量。

式中：X——試樣中氯丙醇酯含量 （均以游離態(tài)氯丙醇計(jì)），單位為mg/kg；

A——由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中氯丙醇酯的質(zhì)量，單位為ng；

m——食用油的取樣量，單位為g；

2 不確定度的來源

通過對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行分析，不確定度的來源主要有重復(fù)性（隨機(jī)效應(yīng)）、回收率（樣品前處理）、樣品稱量、內(nèi)標(biāo)加入量、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合等引入的。不確定度因果圖見圖1。

圖1 不確定度因果圖

3 不確定度評定

3．1 測定的重復(fù)性（Rep）引入不確定度 對同一食用植物油樣品進(jìn)行了6次平行測定，測定結(jié)果分別 為 0．775、0．688、0．781、0．702、0．788、0．825mg/kg，平均濃度0．760mg/kg，根據(jù)貝塞爾公式進(jìn)行不確定度計(jì)算：

重復(fù)性的相對不確定度：Urel(rep)=×100%=×100%=2．87%

3．2 回收率（R）引入的不確定度

根據(jù)貝塞爾公式，

回收率相對不確定度：Urel(R)=×100%，Urel(R)=2．69%

用檢測統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)t對平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，在95%置信概率下，當(dāng)t值大于或等于t的臨界值時(shí)，則回收率與1之間有顯著性差異，要引入修正因子，當(dāng)t值小于t的臨界值時(shí)，回收率與1之間無顯著性差異，可以不做回收率校正。

在95%置信概率，自由度n=5時(shí)的t分布臨界值 t0．95(5)=2．57，本研究 t＜t0．95(5)，回收率和 1 之間無顯著性差異，可以不做回收率校正。見表1。

表1 回收率測定結(jié)果

3．3 樣品稱量（W）引入的不確定度 稱取0．1g樣品，據(jù)天平檢定證書其最大允許誤差為±0．05mg，按均勻分布處理（k=)，則稱重不確定度為：u(w)，u(w)0=0．029mg

該標(biāo)準(zhǔn)不確定度需計(jì)算兩次，一次為皮重，一次為總重，則稱量帶入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(w)=，u(w)=0．041mg

稱量引入的相對不確定度：Urel(w)=×100%=0．041%

3．4 加入內(nèi)標(biāo)使用液帶入的不確定度（V） 用量程為 100μl移液器吸取 100μl內(nèi)標(biāo)使用液（2．0μg/ml），根據(jù) JJG 646-2006《移液器檢定規(guī)程》[9]規(guī)定100μl可調(diào)移液器吸取100μl時(shí)容量最大允許誤差為±2．0%，按矩形分布，（k=)，

內(nèi)標(biāo)引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定對為：Urel(v)=×100%=1．15%

3．5 樣品溶液中3-MCPD酯測定濃度（c）帶入不確定度 樣品溶液中3-MCPD酯測定濃度（c）帶入不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品的純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合三部分帶入。

3．5．1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度 3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸二酯標(biāo)準(zhǔn)品，純度為 98．0±0．5%，均勻分布，

標(biāo)準(zhǔn)品帶入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel(c)0=×100%=0．30%

3．5．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制帶入的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制帶入的不確定度由3-MCPD酯標(biāo)準(zhǔn)儲備液、中間液及使用液的配制三部分帶入。

3．5．2．1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制帶入的不確定度 準(zhǔn)確稱取3-MCPD酯標(biāo)準(zhǔn)品10mg于10．0ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解并定容，濃度1．0mg/ml。標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制帶入不確定度包括三部分，天平稱量（m）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

天平稱量（m）：根據(jù)天平的檢定證書，稱量的最大允許誤差為±0．05mg，稱重有兩次稱量獲得（一次為皮重，一次為毛重），因每次都是獨(dú)立稱量結(jié)果，故計(jì)算兩次。u(m)0===0．029mg，u(m)==0．041mg

天平稱量引入的相對不確定度：Urel(m)=×100%=0．41%

容量瓶（v）：10ml容量瓶（根據(jù) JJG 196-2006[10]，A 級允差±0．02ml），按矩形分布：u(v)=×100%=0．12%

溫度變化 （T）：由于溫度波動(dòng)引起的體積變化，溫度波動(dòng)范圍為 （20±5）℃，呈均勻分布，k=，乙酸乙酯的體積膨脹系數(shù)為 1．38×10-3℃-1，產(chǎn)生的體積變化 V=±（10×1．38×10-3×5）=±0．069ml，u(T)=×100%=0．40%

配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液帶入的不確定度：Urel(c)1==0．59%

3．5．2．2 標(biāo)準(zhǔn)中間液配制帶入的不確定度 用單標(biāo)線移液管吸取1．0ml標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50．0ml容量瓶中，正己烷定容，濃度為20．0μg/ml。標(biāo)準(zhǔn)中間液配制帶入不確定度包括三部分，移液管（v0）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

50ml容量瓶 （根據(jù)JJG 196-2006，A級允差±0．05ml），u(v)=×100%=0．058%

溫度變化 （T）：正己烷的體積膨脹系數(shù)為1．36×10-3℃-1。

產(chǎn)生的體積變化 V=±（50×1．36×10-3×5）=±0．34ml，u(T)=×100%=0．39%。

1．0ml單標(biāo)線移液管（根據(jù) JJG 196-2006，A 級允差±0．007ml），u(v)0=×100%=0．40%。

配制標(biāo)準(zhǔn)中間液帶入的不確定度為：Urel(c)2==0．59%。

3．5．2．3 標(biāo)準(zhǔn)使用液配制帶入的不確定度 用單標(biāo)線移液管吸取1．0ml標(biāo)準(zhǔn)中間液于10．0ml容量瓶中，正己烷定容，濃度為 2．0μg/ml。3-MCPD 酯標(biāo)準(zhǔn)使用液配制帶入不確定度包括：移液管（v0）、容量瓶（v）、及溫度變化（T）。

10ml容量瓶 （根據(jù)JJG 196-2006，A級允差±0．02ml），u(v)=×100%=0．12%；

溫度變化 （T）：正己烷的體積膨脹系數(shù)為1．36×10-3℃-1，

產(chǎn)生的體積變化 V=±（10×1．36×10-3×5）=±0．068ml，u(T)=×100%=0．39%；

1．0ml單標(biāo)線移液管（根據(jù) JJG 196-2006，A 級允差±0．007ml），u(v0)=×100%=0．40%

配制3-氯丙醇酯標(biāo)準(zhǔn)使用液帶入的不確定度為：Urel(c)3==0．57%

3．5．2．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶入的不確定度 對標(biāo)準(zhǔn)系列每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行三次測定，由最小二乘法原理進(jìn)行擬合求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0．0065x-0．0017，r2=0．9997，樣品測定 6 次響應(yīng)值：0．505、0．478、0．518、0．490、0．521、0．559， 帶 入 方 程 求 得 濃 度 （ng） 為78．0、78．4、79．9、75．6、80．5、86．3，由此求得 cc=79．0

標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)差：SA=SA=0．036，c=（20+100+200+400+600）/5=264式中，sA—標(biāo)準(zhǔn)

曲線的標(biāo)準(zhǔn)差；p—樣品溶液的測定次數(shù) （p=6）；n—標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定總次數(shù) （n=15）；b—標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；a—標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；cc—由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的樣品溶液中濃度；c—各標(biāo)準(zhǔn)溶液中濃度的平均值；ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出的標(biāo)準(zhǔn)溶液中濃度的測定值。見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶入的不確定度的參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的相對不確定度：Urel(c)4=×100%=4．35%

3．5．2．5 樣品溶液（c）帶入總的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel(c)=4．47%

3．6 合成相對不確定度和擴(kuò)展不確定度

3．6．1 合成不確定度

Urel(X)==6．1%

3．6．2 擴(kuò)展不確定度 按國際慣例，95%置信概率下取包含因子k=2，測量結(jié)果的相對擴(kuò)展不確定度為：U=Urel(X)×k×X，U=6．1%×2×0．760=0．09mg/Kg

3．7 不確定度報(bào)告：X=（0．76±0．09）mg/Kg （k=2，p=95%）

3．8 不確定度各分量結(jié)果 見表3。

表3 各分量的不確定度

4 討論

本次評定將樣品處理過程中的水解、凈化、衍生等操作帶來的不確定度，通過計(jì)算回收率的不確定度來表示。

根據(jù)內(nèi)標(biāo)法的定量原理，本次評定并沒有計(jì)算內(nèi)標(biāo)純度以及配制所帶來的不確定度，因?yàn)橹灰趯?shí)驗(yàn)中對樣品及標(biāo)準(zhǔn)系列加入同一內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，那么內(nèi)標(biāo)溶液的濃度對待測組分的定量將沒有影響，因此只需分析內(nèi)標(biāo)的加入體積所帶來的不確定度。

本文建立了GC-MS法測定食用植物油中3-氯丙醇酯的不確定度評定方法，定量計(jì)算出測量結(jié)果的可信程度，評估了合成不確定度和擴(kuò)展不確定度，對檢測結(jié)果的符合性判定和后續(xù)的試驗(yàn)優(yōu)化工作具有重要意義，通過比較各分量的相對不確定度大小可以看出，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合是不確定度最主要的來源，其次是重復(fù)性與回收率，稱取樣品所帶來的不確定度可以忽略不計(jì)。