HSP70-2基因多態(tài)性與急性胰腺炎的相關(guān)性分析

楊彩芳，閆樂，梁浩衛(wèi)

(1．新密市中醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 新密452370；2．河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

流行病學(xué)研究顯示，急性胰腺炎的發(fā)病率可達(dá)（334～566）/10000 人[1]，特別是在具有暴飲暴食或過度飲酒的人群中，急性胰腺炎的發(fā)病率可持續(xù)性上升。不同的因素均可以促進(jìn)急性胰腺炎的發(fā)生，包括膽道因素、飲食習(xí)慣或感染等均可以增加急性胰腺炎的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。炎癥因子的表達(dá)變化可能通過影響胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞膜完整性，提高胰腺內(nèi)分泌酶的持續(xù)性異常外分泌的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致胰腺間質(zhì)成分的分解代謝，促進(jìn)胰腺炎的發(fā)生發(fā)展[2，3]。 熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是重要的炎癥因子，能夠促進(jìn)胰腺腺體細(xì)胞的損傷，促進(jìn)導(dǎo)管管壁的狹窄，增加胰腺內(nèi)分泌酶釋放入胰腺間質(zhì)成分的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致自身性消化過程的發(fā)生[4]。HSP基因多態(tài)性的改變，能夠通過影響炎癥反應(yīng)過程，加劇胰酶分泌障礙，影響導(dǎo)管上皮的狹窄程度等，參與急性胰腺炎的發(fā)病過程中。本研究選取2016年3月至2017年7月在河南省新密市中醫(yī)院治療的急性胰腺炎患者91例，探討了相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)及其與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2016年3月至2017年7月在河南省新密市中醫(yī)院治療的急性胰腺炎患者91例，其中輕型胰腺炎患者47例（輕型組），重型胰腺炎44例（重型組），采用性別、年齡配對(duì)選取健康志愿者100例作為對(duì)照組，各組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表 1。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺疾病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[3]；②發(fā)病至入院時(shí)間＜72h；③患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有高血壓、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病等慢性基礎(chǔ)性疾??；②妊娠期或哺乳期婦女。

1．2 檢測(cè)方法 基因多態(tài)性檢測(cè)：采集患者的外周血，采用EDYTA抗凝，采用經(jīng)典的苯酚-氯仿法提取DNA，加入SYBR Green 1染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá) 20μl，上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2min、93℃ 1min、55℃ 2min， 共 40 個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后進(jìn)行基因多態(tài)性檢測(cè)：參考multiplexkit試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）使用說明，加入各位點(diǎn)對(duì)應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測(cè)序反應(yīng)。并在ABI1310（Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行電泳，結(jié)果用GENEMAPPER軟件（Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行分析。

1．3 觀察指標(biāo) 觀察兩組HSP70-2基因型和等位基因分布，同時(shí)比較不同預(yù)后患者性別、年齡、淀粉酶、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、總膽固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、CT 嚴(yán)重程度指數(shù)（CT severity index，CTSI）評(píng)分、急性生理與慢性健康評(píng)分Ⅱ（Acute physiological and chronic health score II，APACHEⅡ）。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19．0軟件，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析；兩組基因型情況采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 HSP70-2基因多態(tài)性結(jié)果 HSP70-2基因PCR產(chǎn)物經(jīng)PstⅠ酶切后凝膠電泳顯示GG型（1139bp+936bp）、GA 型 （2075bp+1139bp+936bp）和 AA 型（2075bp）。

2．2 各組HSP70-2基因多態(tài)性比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，輕型組、重型組和對(duì)照組受試者HSP70-2基因型分布符合遺傳Hardy-Weinberg平衡。輕型組、重型組和對(duì)照組HSP70-2基因型和等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），重型組基因型GG和等位基因G比例明顯高于輕型組和對(duì)照組（P＜0．05）；輕型組基因型 GG 和等位基因 G比例明顯高于對(duì)照組（P＜0．05），見表 2。

表2 各組HSP70-2基因型和等位基因分布[n（%）]

2．3 不同預(yù)后患者各指標(biāo)比較 91例急性胰腺炎患者中，最終死亡16例（死亡組），存活75例（存活組）；死亡組和存活組性別、年齡和淀粉酶水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0．05）； 死亡組 CRP、TC、TG、CTSI評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分和基因型 GG比例明顯高于存活組（P＜0．05），見表 3。

2．4 多因素分析 將上述指標(biāo)作為自變量，是否死亡作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示CTSI評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分和HSP70-2基因型GG是急性胰腺炎患者死亡的影響因素 （OR=2．252、2．188 和 1．324，P＜0．05），見表 4。

3 討論

急性胰腺炎的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊叨嗥鞴俟δ芩ソ叩陌l(fā)生，增加不良臨床結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期的臨床隨訪研究顯示，急性胰腺炎導(dǎo)致的患者多器官功能衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血、心腦血管疾病或肝腎功能衰竭的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可顯著上升[8]。一項(xiàng)包含了331例樣本量的胰腺炎的發(fā)病結(jié)局的分析研究顯示，臨床上急性胰腺炎導(dǎo)致的急性肝功能衰竭的發(fā)生率可達(dá)15%以上，而病死率也可達(dá)5%以上[5]。臨床上缺乏對(duì)于急性胰腺炎的早期診斷及臨床預(yù)后評(píng)估指標(biāo)，而本次研究通過對(duì)于炎癥因子的多態(tài)性的研究，能夠?yàn)榕R床上急性胰腺炎患者的臨床預(yù)后評(píng)估提供重要的參考，并可以為揭示急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

表3 死亡組和存活組各指標(biāo)比較

表4 多因素分析

炎癥因子的改變，不僅能夠參與感染、惡性腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生過程中，同時(shí)炎癥因子的表達(dá)水平變化還能夠通過誘導(dǎo)腺體細(xì)胞的內(nèi)分泌功能的改變，加劇局部?jī)?nèi)分泌腺體組織的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)組織間質(zhì)成分的水腫，導(dǎo)致消化酶的排出困難[6，7]。炎癥因子多態(tài)性的改變，能夠影響炎癥因子的生物學(xué)活性，導(dǎo)致胰腺間質(zhì)成分的滲出性病變、出血、機(jī)化及組織間質(zhì)成分的代償性增生等病理過程，影響胰腺炎的發(fā)病過程[8，9]。HSP70-2基因多態(tài)性包括45kb的DNA序列，上游包含12個(gè)外顯子及8個(gè)內(nèi)含子。HSP多態(tài)性的改變，還能夠影響下游白細(xì)胞介素（IL）-6或者IL-10等生物學(xué)因子的變化，促進(jìn)單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞等對(duì)于胰腺組織的浸潤(rùn)，提高消化酶對(duì)于自身組織的侵蝕程度[10，11]。作為HSP多態(tài)性的重要成分，HSP70-2基因多態(tài)性已經(jīng)被證實(shí)參與惡性腫瘤的發(fā)生過程，但在急性胰腺炎的發(fā)病過程中作用機(jī)制的分析研究不足。

在不同病情的急性胰腺炎患者中，基因型GG和等位基因G的表達(dá)具有顯著的差異，其中患者的病情越重，其基因型GG和等位基因G的表達(dá)比例越高，提示HSP基因多態(tài)性可能顯著影響了急性胰腺炎的發(fā)病過程，同時(shí)其能夠影響患者的病情進(jìn)展速度，導(dǎo)致多器官功能衰竭的發(fā)生，從機(jī)制上考慮，HSP70-2多態(tài)性中基因型GG和等位基因G的差異對(duì)于患者病情的影響，可能與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)[12，13]：①HSP70-2基因的GG或G等位基因的表達(dá)差異，能夠?qū)е禄颊逪SP上游轉(zhuǎn)錄基因活性的改變，導(dǎo)致HSP的炎癥浸潤(rùn)的加劇，促進(jìn)患者肝腎上皮組織細(xì)胞的炎癥損傷，影響患者的臨床治療預(yù)后；②HSP70-2基因區(qū)域G等位基因多態(tài)性的改變，能夠影響細(xì)胞膜上鈣離子通道的開放，進(jìn)而進(jìn)一步加劇胰腺組織的缺血/再灌注損傷，導(dǎo)致胰腺導(dǎo)管的痙攣及狹窄。付林堯等[14]在探討了83例樣本量的急性胰腺炎患者的臨床結(jié)局后發(fā)現(xiàn)，HSP高表達(dá)的患者中，胰腺炎治療后的病死率可達(dá)4%以上，同時(shí)HSP多態(tài)性中等位基因型的差異，能夠顯著影響患者的胰腺消化酶的釋放速度，增加導(dǎo)管阻力，提高消化酶突破導(dǎo)管后浸潤(rùn)胰腺間質(zhì)成分的風(fēng)險(xiǎn)，這與本次研究的結(jié)論較為一致。在病死組胰腺炎患者中，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇（total cholesterol，TC）、胰腺炎嚴(yán)重程度床邊指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（CTSI)等指標(biāo)顯著上升，表明血脂代謝紊亂或胰腺炎相關(guān)危重癥評(píng)分體系是影響急性胰腺炎患者臨床預(yù)后的重要指標(biāo)，而多態(tài)性的分析也可以發(fā)現(xiàn)，基因型GG比例顯著上升，表明基因型的改變能夠影響患者的臨床預(yù)后，其原因主要考慮與HSP多態(tài)性的改變對(duì)于患者病情進(jìn)展過程中胰腺組織中消化酶的分泌速度、急性腎功能衰竭的發(fā)生等的影響有關(guān)。最后，相關(guān)分析也可以發(fā)現(xiàn)，CTSI評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分和HSP70-2基因型GG是急性胰腺炎患者死亡的影響因素，進(jìn)一步提示了HSP70-2基因多態(tài)性對(duì)于患者臨床預(yù)后的影響[15]，這主要由于CTSI評(píng)分、APACHEⅡ評(píng)分能夠反應(yīng)患者的病情嚴(yán)重程度，評(píng)估胰腺組織病理性損害的程度；而HSP70-2基因多態(tài)性對(duì)于患者臨床預(yù)后的影響，這主要考慮與HSP70-2基因多態(tài)性影響到胰腺組織的自身損傷、促進(jìn)瀑布式炎癥反應(yīng)的激活等因素有關(guān)。

綜上所述，HSP70-2基因型GG或者G等位基因的表達(dá)變化，能夠影響急性胰腺炎的病情進(jìn)展，并與患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。