GC-MS測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定

宋迎春，袁婭，王艷敏，周鴻

(江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌330029)

五氯酚（PCP）是一種有機氯農(nóng)藥，常見的形式為五氯酚及其鈉鹽，主要作為殺蟲劑、滅菌劑、除草劑及木材防腐劑使用，我國很多區(qū)域環(huán)境介質(zhì)中均檢出有五氯酚鈉殘留[1-3]。五氯酚可通過吸入、食入和經(jīng)皮吸收等途徑進入體內(nèi)，并在體內(nèi)產(chǎn)生蓄積[4-6]。研究表明，五氯酚對人體造成的毒性有急性中毒[7]、生殖毒性[8，9]、致畸毒性[10]、遺傳毒性[11-13]、細胞毒性[14，15]、免疫毒性[16，17]等，五氯酚是包括我國在內(nèi)的許多國家環(huán)境優(yōu)先監(jiān)測污染物之一，國際癌癥研究機構（IARC）也將五氯酚列為第Ⅰ類致癌物。2008年，原國家環(huán)保總局將PCP列為“高污染、高環(huán)境風險”產(chǎn)品[18]。

依據(jù)新版CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》中7．6“測量不確定度的評定”要求，開展檢測的實驗室應評定測量不確定度。本研究依據(jù)JJF 1059．1-2012《測量不確定度評定與表示》技術規(guī)范[19]，借鑒本實驗室化學分析不確定度評定方法[20]，擬建立GC-MS測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定方法。通過對測量過程和測量系統(tǒng)的深入分析研究，識別不確定度來源，列出影響測定結(jié)果的不確定度因素，同時計算各標準不確定度分量和相對擴展不確定度，最后評估各分量對合成不確定的相對貢獻，從而為GC-MS內(nèi)標法測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑 五氯酚標準儲備液（100μg/ml）（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所）；2，4-二溴酚（德國Dr公司）；正己烷、乙酸乙酯、乙腈和丙酮（色譜純，德國Merk公司）；吡啶和碳酸鉀（分析純，國藥集團）；乙酸酐（分析純，西隴科學）；三氯乙酸（分析純，科密歐公司）；SLC固相萃取小柱（500mg/6ml，杭州福?？萍挤沼邢薰荆?。

1．2 儀器與設備 7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國 Agilent公司）；SORVALL LYNX6000 高速冷凍離心機（美國Thermo）；AH-30勻漿機（上海?？疲?。

1．3 儀器條件 色譜條件：色譜柱：DB-5MS（30m×0．25mm×0．25μm）；柱溫：初溫 80℃，保持 2min，以10℃/min升至 250℃，290℃后運行 4min；進樣口溫度：230℃；載氣流速：1．0ml/min；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1μl。質(zhì)譜條件：電離方式：EI源，70eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲：10min；掃描方式：選擇離子掃描（SIM）；五氯苯乙酸酯（五氯酚）定性離子 264、268、308，定量離子：266；內(nèi)標 2，4-二溴苯乙酸酯（2，4-二溴酚）定性離子 250、254，定量離子：252。

1．4 樣品前處理 參照《2018年國家食品污染物和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》。

步驟1：稱樣：稱取豬肉、雞肉等動物組織5．00g 絞碎樣品入離心管內(nèi)，加入 30μl 10．0μg/ml 2，4-二溴酚內(nèi)標液。

步驟2：提取：上述樣品中加入5%三氯乙酸溶液進行勻漿，加入10ml提取液（乙酸乙酯：正己烷=1：9，V/V）提取，提取液離心后，取上層有機相氮吹干，加入乙腈復溶后再離心。

步驟3：凈化：SLC固相萃取柱活化后，取步驟2離心后的復溶液過柱并洗脫收集，洗脫液氮吹至0．5ml左右。

步驟4：衍生：步驟3殘余物中加衍生溶劑（乙酸酐：吡啶=1：1，V/V）0．2ml進行衍生后，加 1ml正己烷提取，再加碳酸鉀溶液靜置分層，取上層有機相供GC-MS測定。

步驟5：取0．25ml五氯酚標準儲備液（100μg/ml）用色譜純丙酮稀釋至 25ml，得到 1．0μg/ml使用液。 再取 10μl、25μl、50μl、100μl、200μl五氯酚標準使用液 （1．0μg/ml）， 分別加入 30μl 10．0μg/ml 2，4-二溴酚內(nèi)標液，同步驟4進行衍生反應。

步驟6：在相同條件下分別測定標準溶液和樣品溶液，制作工作曲線。

步驟7：利用工作曲線，按以下公式計算樣品中五氯酚鈉含量X。五氯酚鈉含量測量結(jié)果由2次測量的平均值給出。

1．5 計算公式 利用GC-MS方法測定五氯酚鈉含量X的表示式為：

式中：X—樣品中五氯酚鈉含量，μg/kg；

c—從標準曲線中得到的樣品溶液中五氯酚含量，μg/L；

V—試樣溶液的定容體積，ml；

m—試樣質(zhì)量，g；

1．08—五氯酚轉(zhuǎn)化成五氯酚鈉系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2．1 不確定度來源分析 根據(jù) CNAS-CL01：2018《檢測和校準實驗室能力認可準則》要求，實驗室應識別測量不確定度的貢獻，評定測量不確定度時，應采用適當?shù)姆治龇椒紤]所有顯著貢獻。根據(jù)JJF 1059．1-2012[19]技術規(guī)范，合成標準不確定度組成包括A類標準不確定度和B類標準不確定度。測量重復性引入的標準不確定度分量采用A類評定方法；標準物質(zhì)定值、擬合校準曲線、移液器、容量瓶、溫度變動、天平和GC-MS儀器等因素引入的標準不確定度分量采用B類評定方法。其它諸如內(nèi)標物質(zhì)定值和配制過程引入的不確定度對本實驗影響較小，故本文未做討論。本方法不確定度來源主要組成見圖1。

圖1 不確定度主要來源分析

2．2 不確定度分量評定

2．2．1 A類標準不確定度UArel評定 在重復性條件下，對同一試樣從取樣開始獨立重復測量7次，測量數(shù)據(jù)見表1。

方法規(guī)定，五氯酚含量由2份樣品的測量結(jié)果平均值給出為X=3．65μg/kg，所以五氯酚含量測量重復性引入的相對標準不確定度UArel為

2．2．2 B 類標準不確定度 UBrel評定

2．2．2．1 體積V的標準不確定度評定 容量瓶引入的體積V標準不確定度分量UB1rel（V）實驗過程用到25ml容量瓶對五氯酚儲備液進行稀釋，根據(jù)JJG 196-2006《中華人民共和國國家計量檢定規(guī)程常用玻璃量器》[21]制造商提供的A級容量瓶在20℃時的體積為 25±0．04ml，假設為三角形分布，包含因子 kB1（V）=。由此引入的相對標準不確定度 UB1rel（V）為

表1 7份試樣五氯酚含量獨立重復測定結(jié)果

溫度引入的體積V標準不確定度分量UB2rel（V）容量瓶已在20℃校準，而實驗室的溫度在（20±5）℃之間變化。丙酮的體積膨脹系數(shù)為 1．43×10-3℃-1，服從均勻分布，區(qū)間半寬度為 5℃×1．43×10-3℃-1=7．15×10-3，包含因子 kB2（V）=，由此引入的相對標準不確定度 UB2rel（V）為

移液器引入的體積V標準不確定度分量UB3rel（V）配制五氯酚使用液時，需要用量程100-1000μl的移液槍移取儲備液，根據(jù)檢定證書，這支移液槍的相對誤差為0．4%，假設為三角分布，kB3-1（V）=，因此移取250μl溶液產(chǎn)生的相對標準不確定度 UB3-1rel（V）為

配制五氯酚工作曲線時需要用量程

10-100μl和20-200μl的移液槍移取使用液，根據(jù)檢定證書，兩支移液槍的相對誤差分別為1．4%和2．8%，假設為三角分布，kB3-2（V）=，因此移取10μl、25μl、50μl、100μl、200μl溶液產(chǎn)生的相對標準不確定度分別為 0．57%、0．57%、0．57%、0．57%、1．14%。移液槍引入的不確定度分量互不相關，采用方和根方法合成：

體積 V的 3個不確定度分量 UB1rel（V）、UB2rel（V）和 UB3rel（V）互不相關，采用方和根方法合成

2．2．2．2 標準物質(zhì)定值 W 的不確定度 UBrel（W）評定由標準物質(zhì)證書可知，五氯酚不確定度為0．08μg/ml，假設服從均勻分布，包含因子kB（W）=，由此引入的相對標準不確定度UBrel（W）為

2．2．2．3 擬合校準曲線 C 的不確定度 UBrel（C）評定校準曲線采用5個濃度的標準溶液擬合，每個濃度均進行3次平行試驗，共n=15個校準點，校準曲線公式為Ai=a+bCi

式中，Ci為標準溶液的濃度，μg/ml；Ai為標準溶液濃度Ci的峰面積與內(nèi)標峰面積的比值；a為截距；b為斜率。由實驗數(shù)據(jù)計算給出斜率、截距和相關系數(shù)如下

Ai=a+bCi=0．0019+0．0022Ci

對試樣進行2次（m=2）平行測量，得到平均峰面積比A0和平均試樣濃度C0為

回歸的標準偏差

由此可計算出最小二乘法擬合校準曲線引入的相對標準不確定度UBrel（C）為

2．2．2．4 儀器 I的不確定度 UBrel（I）評定 天平引入的標準不確定度UB1rel（I）評定 電子天平經(jīng)檢定合格，由天平檢定證書可知其最大允許誤差為±1．5mg，服從均勻分布，包含因子 kB1（I）=。由此引起的相對標準不確定度UB1rel（I）為

GC-MS引入的標準不確定度UB2rel（I）評定 由GC-MS檢定證書可知，取包含因子kB2（I）=2時，GC-MS的相對擴展不確定度為4%。由此引起的相對標準不確定度 UB2rel（I）為

儀器I的2個不確定度分量UB1rel（I）和UB2rel（I）互不相關，采用方和根方法合成

2．2．2．5 合成B類不確定度 本實驗過程中各B類不確定度分量互不相關，綜合以上分量結(jié)果，采用方和根方法合成B類標準不確定度

2．3 相對合成標準不確定度評定 將A類和B類標準不確定度采用方和根方法合成，計算五氯酚鈉含量的相對合成標準不確定度

2．4 相對擴展標準不確定度評定 取包含因子k=2，包含概率P≈95%，則樣品中五氯酚鈉含量測量結(jié)果的相對擴展不確定度Urel為

2．5 五氯酚鈉含量測量結(jié)果及其不確定度報告五氯酚鈉含量測量結(jié)果由2份試樣的平均值給出為X=3．68μg/kg。五氯酚鈉含量測量結(jié)果的相對擴展不確定度Urel=17%，由合成標準不確定度乘以包含因子k=2給出，提供P≈95%的包含概率。見表2。

表2 五氯酚鈉含量X測量結(jié)果的不確定度分量匯總表

3 討論

本文通過對GC-MS法測定動物組織中五氯酚鈉的不確定度進行評定，通過較全面的分析檢測過程中的不確定度來源，計算各不確定度分量，從表2來看，擬合工作曲線對本實驗過程不確定貢獻最大，占58．8%，這與多數(shù)評定氣相色譜法測量過程不確定度的研究結(jié)果一致；其次是GC-MS、移液槍校準和測量重復性引入的不確定度對評定結(jié)果的影響， 分別占 15．1%、12．2%和 9．8%。 容量瓶、溫度、標準物質(zhì)和天平等因素對不確定度貢獻相對較小。建議通過增加樣品和標準曲線每個濃度的測定次數(shù)、提高檢驗人員的操作規(guī)范性和熟練程度等措施來降低測量不確定度，提高結(jié)果的準確性和可靠性。