聯(lián)合檢測(cè)血清Myo、cTn I、GDF-15及miRNA-499對(duì)AMI的診斷價(jià)值

潘廣杰

(鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院心內(nèi)科，河南 洛陽(yáng) 471009)

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病情進(jìn)展，能夠?qū)е禄颊邜盒孕难芙Y(jié)局事件的發(fā)生，增加患者的病死率。流行病學(xué)研究顯示，AMI的發(fā)病率可達(dá)334～566/10萬(wàn)人左右[1]。AMI的早期診斷具有重要的意義，能夠指導(dǎo)臨床上早期的溶栓或者介入等治療。但現(xiàn)階段臨床上包括心肌肌鈣蛋白 I（cardiac troponin I，cTnI）、肌紅蛋白（myoglobin，Myo）等心肌酶譜蛋白，在 AMI的診斷過(guò)程中雖然具有一定的參考價(jià)值，但其診斷的靈敏度或者特異度仍然不夠理想。血清生長(zhǎng)分化因子-15 （growth differentiation factor-15，GDF-15）能夠通過(guò)誘導(dǎo)下游趨化因子的激活，促進(jìn)心肌細(xì)胞的損傷及壞死[2，3]； 微小RNA-499 （miRNA-499）能夠通過(guò)調(diào)控缺血條件下的心肌細(xì)胞的凋亡程度，從而參與到AMI的病情進(jìn)展過(guò)程中[4，5]。為了進(jìn)一步揭示血清 Myo、cTn I、GDF-15及 miRNA-499的異常表達(dá)與AMI的病情關(guān)系，為臨床上AMI的診斷提供血清學(xué)參考，本次研究選擇了相關(guān)AMI、 不穩(wěn)定型心絞痛 （unstable angina pectoris，UAP）、穩(wěn)定型心絞痛（stable angina pectoris，SAP）等，探討了相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)及其診斷學(xué)價(jià)值。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2014年4月至2016年8月期間我院確診的AMI患者80例 （AMI組）、80例不穩(wěn)定型心絞痛患者（UAP組）、穩(wěn)定型心絞痛患者80例（SAP組）、選取80例健康體檢對(duì)象作為對(duì)照組。

AMI組，男 50例、女 30例，年齡 44～79 歲，平均 56．4±11．6 歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）22．9±2．1kg/m2，合并高血壓38例、糖尿病17例、高血脂29例。UAP組，男 46例、女 34例，年齡 46～79歲，平均58．0±10．2 歲，BMI 22．5±2．3kg/m2， 合并高血壓 41例、糖尿病14例、高血脂32例。SAP組，男47例、女 33 例， 年齡 41～79 歲， 平均 55．8±12．0 歲，BMI 23．2±2．5kg/m2，合并高血壓 34 例、糖尿病 20 例、高血脂27例。對(duì)照組，男48例、女32例，年齡44～79歲，平均 57．2±12．0 歲，BMI 23．1±2．4kg/m2。 四組研究對(duì)象的年齡、性別、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；AMI組、UAP 組及 SAP 組患者的合并疾病情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴AMI、UAP、SAP 三組患者的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；⑵患者年齡范圍18～79歲；⑶患者經(jīng)冠脈造影檢測(cè)，至少發(fā)現(xiàn)一支冠狀動(dòng)脈的狹窄程度＞50%；⑷對(duì)照組來(lái)源于本院體檢中心的健康自愿者；⑸本研究獲得研究對(duì)象的知情同意。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴伴有全身感染性疾??；⑵惡性腫瘤；⑶血液系統(tǒng)疾??；⑷心臟瓣膜疾病、嚴(yán)重的心律失常、心力衰竭；⑸長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑、激素類藥物。

1．3 指標(biāo)檢測(cè)方法 清晨采集空腹靜脈血，-20℃保存待測(cè)，采集標(biāo)本后1周內(nèi)檢測(cè)GDF-15、cTnI、Myo。采用電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀(美國(guó)雅培i2000)及試劑盒，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自福建新大陸生物技術(shù)有限公司。

miRNA-499的檢測(cè)：采集患者靜脈血2ml，按照2000r/min的離心速度進(jìn)行離心分離血清，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用RT-PCR檢測(cè)miRNA-499濃度，底物中加入上游引物0．5uM、下游引物0．5uM，RT-PCR反應(yīng)混合液5ul，dNTP稀釋至20ul，反應(yīng)條件：95℃3min、95℃15s、90℃5s， 一共 40 個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物擴(kuò)增長(zhǎng)度為134bp。miRNA-499引物序列：上游 引 物 （F）：5’CATGGGTTGTGTCAGTGTCAGAGCT-3’ 下 游 引 物 （R）：5’．丁 GCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3’。

miRNA-499相對(duì)量的計(jì)算：采用GenEx軟件分析方法來(lái)進(jìn)行miRNA相對(duì)定量分析。GenEx軟件可通過(guò) http：www．qpcrforum．com 下載，將目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率輸入軟件中，根據(jù)軟件的相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2．1 四 組 研 究 對(duì) 象 的 血 清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較 AMI組患者的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平均顯著的高于 UAP組、SAP組和對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0．05）；UAP 組、SAP 組患者的血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平均顯著的高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；見(jiàn)表 1。

表1 四組研究對(duì)象的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平比較

表1 四組研究對(duì)象的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平比較

注：與 AMI組比較 aP＜0．05，與對(duì)照組比較 bP＜0．05。

GDF-15（g/L）cTnI（μg/L）Myo（ng/ml）miRNA-499（相對(duì)表達(dá)量）3．14±1．77 1．62±0．83ab 1．55±0．69ab 0．48±0．14a 41．284＜0．001 3．50±1．30 1．44±0．54ab 1．28±0．57ab 0．32±0．12a 63．381＜0．001 165．9±42．3105．8±28．9ab 98．5±26．4ab 68．3±17．4a 29．462＜0．001 3．39±1．70 1．50±0．74ab 1．39±0．67ab 0．89±0．41a 35．667＜0．001組別 n AMI組UAP組SAP組對(duì)照組F值P值80 80 80 80

2．2 AMI 患者治療前后血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較 治療后AMI組患者的血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 水平均較本組治療前顯著的降低 P＜0．05）；見(jiàn)表 2。

表2 治療前后AMI患者GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較

表2 治療前后AMI患者GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平比較

GDF-15（g/L）cTnI（μg/L）Myo（ng/ml）miRNA-499（相對(duì)表達(dá)量）3．14±1．77 1．33±0．69 8．522＜0．001 3．50±1．50 1．42±0．61 11．489＜0．001 165．9±42．394．7±22．1 13．344＜0．001 3．39±1．70 1．14±0．56 11．244＜0．001時(shí)間 n治療前治療后4周t值P值80 80

2．3 診斷價(jià)值評(píng)估 通過(guò)檢測(cè)血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平對(duì)于鑒別診斷AMI均具有一定的臨床價(jià)值，見(jiàn)表3和圖1；血清GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平聯(lián)合檢測(cè)用于鑒別診斷AMI的靈敏度為96．42%、特異度為91．75%、漏診率為 3．58%、誤診率為 8．52%、AUC 值為 0．933。

3 討論

心肌梗死的發(fā)生，一方面主要考慮與長(zhǎng)期的心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的繼發(fā)性粥樣硬化斑塊形成有關(guān)，另一方面考慮與心血管內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致的血管相對(duì)性狹窄有關(guān)[6]。心肌梗死的患者的致殘率或者致死率可達(dá)25%以上，且心室壁破裂、腦血栓等惡性臨床結(jié)局事件的發(fā)生率可明顯上升[7]。而通過(guò)對(duì)心肌梗死發(fā)病過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究，可以為臨床上揭示心肌梗死的臨床預(yù)后評(píng)估提供潛在的血清學(xué)參考指標(biāo)，提高AMI的早期診斷水平，改善臨床預(yù)后。

表3 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用診斷AMI的臨床價(jià)值

圖1 各項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用診斷AMI的ROC曲線圖

過(guò)度釋放的GDF-15能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞等對(duì)于內(nèi)皮下組織的浸潤(rùn)，加劇血管的狹窄。GDF-15還能夠參與心肌細(xì)胞的脂肪代謝，參與心肌細(xì)胞不飽和脂肪酸的合成。AMI患者體內(nèi)由于心肌細(xì)胞膜完整性的破壞，GDF-15顯著釋放入血，體內(nèi)上升的GDF-15又可以誘導(dǎo)下游IL-6或者IL-10，導(dǎo)致粥樣斑塊的形成，促進(jìn)了部分血管壁的脆性改變[8，9]；Myo、cTn I是重要的心肌酶譜，其表達(dá)濃度在AMI發(fā)生3～6h內(nèi)即可顯著上升，對(duì)于心肌細(xì)胞膜的損傷具有一定的標(biāo)志作用，心肌細(xì)胞損傷的早期即可出現(xiàn)外周血中相關(guān)指標(biāo)的顯著改變，但其單獨(dú)診斷AMI的靈敏度較低，可靠性不足[10，11]；miRNA-499 不僅參與到惡性腫瘤、 自身免疫性疾病等的發(fā)生過(guò)程，同時(shí)能夠影響冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)局部血栓形成，增加心肌細(xì)胞的缺血程度，參與到AMI的病情進(jìn)展過(guò)程[12，13]。部分研究已經(jīng)揭示了Myo、cTn I等常規(guī)心肌酶譜指標(biāo)在AMI中的異常表達(dá)情況，但對(duì)于GDF-15等的分析不足。

本次研究通過(guò)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)分析可見(jiàn)，GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 等指標(biāo)在 AMI血清中均存在顯著的高表達(dá)趨勢(shì)，其表達(dá)濃度明顯高于SAP或者UAP患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同 時(shí) 在 心 絞 痛 患 者 血 清 中 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499等的表達(dá)也明顯上升，高于正常人群，這些均提示了相關(guān)因子均參與到了冠狀動(dòng)脈性心臟病的病情進(jìn)展過(guò)程中，從機(jī)制上考慮，相關(guān)指標(biāo)對(duì)于心血管病的影響可能與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)：⑴GDF-15的高表達(dá)，能夠促進(jìn)單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞對(duì)于心肌細(xì)胞的浸潤(rùn)，增加心肌細(xì)胞膜完整性的破壞；⑵在心肌梗死的病程中，由于缺血再灌注損傷的發(fā)生，miRNA-499的表達(dá)也可明顯上升；⑶cTnI、Myo的表達(dá)上升則與心肌細(xì)胞膜完整性的破壞導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)心肌酶譜的釋放有關(guān)。渠樂(lè)等[14]研究者在探討了63例樣本量的AMI患者的血清學(xué)資料改變，發(fā)現(xiàn)cTnI、Myo可平均上升25%、30%以上，同時(shí)患者的病死率越高，治療后的惡性心血管結(jié)局事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高，cT-nI、Myo等的表達(dá)上升幅度越為明顯。同時(shí)相關(guān)對(duì)癥治療后，如溶栓、介入或者抗凝等治療，AMI患者的血清中相關(guān)生物學(xué)分子均明顯下降，趨勢(shì)逐漸回落，進(jìn)一步提示了 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499等指標(biāo)與AMI患者的病情關(guān)系，這主要與治療過(guò)程中損傷心肌細(xì)胞膜的修復(fù)、壞死心肌細(xì)胞的吸收等作用有關(guān)[15]。任何單一指標(biāo)診斷AMI的靈敏度或者特異度等指標(biāo)均不理想，其均存在不同程度的漏診或者誤診的發(fā)生，而通過(guò)聯(lián)合GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499 等進(jìn)行聯(lián)合診斷后，AMI的診斷靈敏度或者特異度均可達(dá)90%以上，臨床參考價(jià)值較為可靠。

綜上所述， 血清 GDF-15、cTnI、Myo、miRNA-499水平在AMI中異常高表達(dá)，而聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于鑒別診斷AMI具有較好的臨床參考價(jià)值。