不同程度宮頸病變患者陰道微生物群落差異比較分析

梁文麗，謝愛香

(1．濮陽市中醫(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 濮陽457000；2．濮陽市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，河南 濮陽 457000)

宮頸癌是我國女性第二常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生情況占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第一位，宮頸癌前病變是女性具有癌變可能，但臨床尚未診斷為原位癌的宮頸異常增殖性病變，具有發(fā)展為惡性腫瘤的可能，患者長期存在可能會發(fā)展為宮頸癌[1-3]。宮頸上皮細(xì)胞暴露于陰道女性陰道微環(huán)境中，女性陰道微環(huán)境對保護(hù)其陰道微環(huán)境穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用，故臨床醫(yī)務(wù)人員對陰道微生物在宮頸病變發(fā)展過程中是否具有一定作用仍存在疑問，既往研究中對陰道微生態(tài)的評價多依靠采集女性陰道分泌物涂片及結(jié)合陰道等功能性指標(biāo)，但臨床工作中會受到多種因素干擾進(jìn)而影響結(jié)果情況[4-8]。本次研究選取濮陽市中醫(yī)院婦科42例宮頸病變患者以及同期于濮陽市中醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的23例健康女性的臨床資料進(jìn)行回顧性研究分析，目的在于研究分析不同程度宮頸病變患者陰道微生物群落差異。

1 一般資料與方法

1．1 一般資料 選取 2017年 1月至 2018年 6月濮陽市中醫(yī)院婦科42例宮頸病變患者作為研究對象，根據(jù)患者宮頸病變情況進(jìn)行分組，其中22例宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級患者為觀察A組，其20例宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ/Ⅲ級患者作為觀察B組；采取同期于濮陽市中醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的23例健康女性作為對照組。其納入標(biāo)準(zhǔn)為：⑴觀察組兩組患者診斷符合 《宮頸病變以及宮頸癌檢查教程》[9]中對宮頸上皮內(nèi)瘤變診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵所有觀察人員為已婚女性；⑶所有觀察人員月經(jīng)規(guī)律；⑷近1個月內(nèi)無使用抗生素以及陰道沖洗藥物；⑸所有觀察人員近1周陰道無異常分泌物及流血；⑹所有觀察人員近1周無性生活；⑺所有觀察人員或家屬知情并簽署知情同意書，排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴存在泌尿生殖器炎癥；⑵存在糖尿病、心、肝等內(nèi)科疾??；⑶具有長期使用皮質(zhì)類固醇以及免疫抑制劑史。觀察組A組患者平均年齡為41．24±1．27歲，觀察組B組患者平均年齡為42．07±1．25歲，對照組患者平均年齡為41．54±1．31歲；比較三組患者平均年齡等一般資料差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性。本次研究內(nèi)容經(jīng)濮陽市中醫(yī)院倫理學(xué)會批準(zhǔn)執(zhí)行。

1．2 方法 采用無菌棉拭子于所有研究人員陰道后穹窿處轉(zhuǎn)動15s左右，待無菌棉拭子充分吸收研究人員陰道內(nèi)分泌物后放入干燥無菌試管中，采集好的標(biāo)本結(jié)束后放置于冰箱保存，用于細(xì)菌基因組提取。細(xì)菌基因DNA提取試劑盒采用德國進(jìn)口試劑盒，其具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取結(jié)束后放置于冰箱進(jìn)行保存。本次研究采用稀釋提取的基因組為模板，其引物序列見表1。PCR產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并根據(jù)其PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混合。本次研究生物信息學(xué)分析選擇MiSeq軟件的默認(rèn)指數(shù)對其原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行測定，并去除其接頭數(shù)列以及低質(zhì)量數(shù)列的預(yù)處理，利用其命令進(jìn)行對標(biāo)本菌群的主成分分析以及不同組間群落結(jié)構(gòu)以及菌群差異。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)資料均采用SPSS 20．0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式表示，計數(shù)資料采用例數(shù)（%）的方式表示。組間計量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 比較觀察A、B兩組與對照組多樣性指數(shù)差異比較三組患者辛普森指數(shù)以及香農(nóng)指數(shù)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；比較三組患者 Chao 指數(shù)以及ACE指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0．05）；觀察A組患者Chao指數(shù)以及ACE指數(shù)明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；觀察 B 組患者Chao指數(shù)以及ACE指數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；見表 2。

表2 比較觀察A、B兩組與對照組多樣性指數(shù)差異

2．2 比較三組患者菌群結(jié)構(gòu) 檢測三組患者菌群結(jié)構(gòu)共23個菌門，其中對照組患者陰道菌群323080為厚壁菌門組成，占78．69%，65692為放線菌門，占16%；剩余 21個菌門占 5．31%（21801）；觀察 A 組厚后壁菌門組成比例降低為254719，占64．86%，放線菌門增多至108823，占27．71%；剩余21菌門占比提高至29140，占7．43%；觀察B組患者陰道菌門、菌屬情況與對照組分布情況基本一致。觀察B組與對照組均為以乳酸桿菌為主，存在256376，占比71．80%，加德納菌屬占比 12．91%，為 46091，奇異菌屬僅占比3．29%，剩余菌屬為普雷奧、奇異以及斯尼斯菌等，占比為12．00%；觀察A組中，乳酸桿菌屬含量下降至220945，占比56．26%；加德納菌屬上升至 76974．占 19．60%，其奇異菌屬含量上升為30240，占7．7%剩余菌屬為普雷奧、奇異以及斯尼斯菌等，占比為 16．44%．見圖 1、圖 2。

圖1 三組患者菌門占比情況餅狀圖

2．3 菌群類型 陰道菌群通常分為4種，其中分別以卷曲乳酸桿菌、加氏乳酸桿菌以及惰性乳酸桿菌為優(yōu)勢菌，而各種厭氧菌組成的陰道菌群Ⅳ，比較三組患者陰道菌群類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0．05）；見表 3。

表3 比較三組患者陰道菌群類型

3 討論

宮頸癌是目前病因明確的婦科惡性腫瘤，與高危型人乳頭瘤病毒的持續(xù)感染相關(guān)，但由高危型人乳頭瘤病毒發(fā)展為宮頸癌需要經(jīng)歷較為漫長且可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期，雖在現(xiàn)代醫(yī)療水平下對于導(dǎo)致宮頸癌前病變進(jìn)展的原因尚不明確，但由有部分報道表明陰道微生態(tài)的組成以及變化與宮頸癌前病變的進(jìn)展具有一定相關(guān)關(guān)系[10-14]。采用傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)對女性進(jìn)行鑒定特異性細(xì)菌對多樣性陰道微生態(tài)菌落上不全面[15，16]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平以及科技的不斷發(fā)展，傳統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)耗時長、工作量大且不能完整反映等缺點逐一顯現(xiàn)，而新興技術(shù)具有成本低、操作簡單等特點逐漸廣泛運(yùn)用于臨床中，使關(guān)于不同程度宮頸病變患者引導(dǎo)微生物群落差異情況得到進(jìn)一步研究[15，16]。

比較三組患者Chao指數(shù)以及ACE指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；觀察 A 組患者 Chao 指數(shù)以及ACE指數(shù)明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；健康女性陰道菌群主要由厚壁菌門組成，以乳酸桿菌為主，與本次研究中結(jié)果一致，本次研究中檢測三組患者菌群結(jié)構(gòu)共23個菌門，其中對照組患者陰道菌群323080為厚壁菌門組成，占 78．69%，65692 為放線菌門，占 16%；剩余 21個菌門占5．31%（21801）；觀察A組后壁菌門組成比例降低為254719，占64．86%，放線菌門增多至108823，占 27．71%；剩余 21菌門占比提高至29140，占7．43%；觀察B組患者陰道菌群與對照組分布情況基本一致。通常情況下，女性陰道微生物中乳酸桿菌為主，其對保持女性陰道微生態(tài)平衡以及抑制病原微生物生長、增強(qiáng)女性陰道局部抗感染、抗腫瘤能力具有至關(guān)重要的意義。乳酸桿菌能夠保護(hù)女性陰道黏膜上皮細(xì)胞不會受到病原菌的黏附，且還能夠分泌出形成生物膜的物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到組織病原菌黏附以及侵襲的目的。觀察B組與對照組均為以乳酸桿菌為主，存在256376，占比71．80%，加德納菌屬占比 12．91%，為 46091，剩余菌屬為普雷奧、奇異以及斯尼斯菌等；觀察A組中，乳酸桿菌屬含量下降至220945，占比56．26%；加德納菌屬上升至76974．占19．60%，其奇藝異菌屬含量上升為30240，占7．7%；本次研究中乳酸桿菌在觀察A組患者中的標(biāo)本中較少，說明乳酸桿菌數(shù)量下降會造成女性陰道微生態(tài)平衡受到破壞以及女性患者陰道微環(huán)境的變化，進(jìn)而造成宮頸上皮對高危型人乳頭瘤病毒的易感性增加，而觀察B組乳酸桿菌含量與健康女性無差異說明宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ/Ⅲ級患者病變與乳酸桿菌相關(guān)意義不大。本次研究中發(fā)現(xiàn)奇異菌屬在觀察兩組中出現(xiàn)明顯增多，既往有研究發(fā)現(xiàn)宮頸病變風(fēng)險增加與患者宮頸菌群中奇異菌屬上升具有一定關(guān)系，奇異菌在一定程度上能夠刺激患者陰道上皮細(xì)胞的固有免疫，故奇異菌能夠參與到宮頸病變的過程中。比較三組患者陰道菌群類型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；根據(jù)本次研究菌落類型結(jié)果可知大多數(shù)患者檢驗結(jié)果提示為惰性乳酸桿菌以及卷曲乳酸桿菌，其中加氏乳酸桿菌為主的菌群類型較少。

綜上所述，不同宮頸病變患者陰道菌群多樣性以及類型與健康女性相似，但宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級患者陰道部分微生物菌類群豐度增加。