血清 Bax、Caspase-3、MDA、8-OHdG 水平與癲癇發(fā)作及認知損害的關系

李磊

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

流行病學研究顯示，癲癇的發(fā)病率可達333～566/10萬人左右[1]。在合并有精神病相關家族史的人群中，癲癇的發(fā)病率可進一步上升。不同的因素或者生物學因子的改變，均可以影響癲癇的發(fā)生，導致患者認知、行為及精神活動功能的異常。其中Bax、Caspase-3作為凋亡相關因子，能夠通過促進神經(jīng)元細胞的凋亡，影響到局部氧化應激反應的發(fā)生，從而影響到神經(jīng)元的生物電活動[2，3]；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、8-羥基脫氧尿苷酸 （8-hydroxy deoxy uridine，8-OHdG）的異常表達，能夠通過誘導下游趨化因子的富集，導致炎癥的浸潤，促進神經(jīng)纖維鞘膜完整性的破壞，增加大腦皮層及海馬等區(qū)域同步電活動的發(fā)生風險[4]。部分研究揭示了MDA在癲癇患者血清中的異常表達情況，認為MDA的表達上升是影響到癲癇患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能惡化的重要風險，但對于Bax、Caspase-3、8-OHdG等的分析研究不足。為了進一步探討血清 Bax、Caspase-3、MDA、8-OHdG 與癲癇發(fā)作、病情及認知損害的關系，從而為臨床上癲癇患者的臨床預后評估提供參考，本次研究選取我院收治的確診的癲癇患者90例，探討了相關指標的異常表達及其與患者認知等功能的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2015年1月至2017年6月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院收治的確診的癲癇患者90例（病例組）、同期健康體檢對象60例（對照組）。病例組，男 49 例、女 41 例，年齡 29～77 歲，平均 48．4±15．6歲，其中癲癇發(fā)作患者62例（全身性強直-陣攣性發(fā)作27例、復雜部分性發(fā)作11例、部分性發(fā)作繼發(fā)全身性強直-陣攣性發(fā)作10例、單純部分性發(fā)作14例），癲癇發(fā)作嚴重程度NHS3評分[1]14．3±3．9 分；癲癇非發(fā)作患者 28 例。 對照組，男 35例、女 25 例，年齡 32～75 歲，平均 45．8±11．4 歲。 兩組研究對象的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。

1．2 納入排除標準

1．2．1 納入標準 ⑴癲癇患者的診斷標準參考中華醫(yī)學會精神病學分會制定的診斷標準；⑵患者年齡范圍18～79歲；⑶患者具有明確的癲癇病史及病因；⑷本研究獲得患者家屬的知情同意。

1．2．2 排除標準 ⑴酗酒患者；⑵合并惡性腫瘤疾病；⑶長期使用卡馬西平、丙戊酸鈉的患者；⑷既往伴有精神、認知功能疾病；⑸合并顱腦創(chuàng)傷、代謝異常、寄生蟲病等。

1．3 檢測方法 MDA、8-OHdG水平的檢測：清晨采集空腹靜脈血，按照2000r/min離心5min分離血清，-20℃保存待測，采集標本后1周內檢測MDA、8-OHdG，采用瑞士羅氏全自動生化分析儀E170模塊進行檢測，檢測試劑盒購自上海泰康生物科技有限公司。

Bax mRNA、Caspase-3 mRNA的檢測：每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0．2ml的氯仿，加 0．2ml氯仿，劇烈搖動 30s， 室溫 3min，3000r/min，4℃離心15min得到RNA。加等體積異丙醇，-20℃，30min，棄上清，加 75%乙醇 1ml，振蕩，20μl DEPC水，室溫放置5min使其完全溶解。加入逆轉錄酶5ul，室溫下放置20min后植入37℃水浴鍋中孵育30min，在底物中加入上游引物0．5uM、下游引物 0．5uM，RT-PCR 反應混合液 5ul，dNTP 稀釋至 20ul，反應條件：95℃ 3min、95℃ 15s、90℃ 5s，一共40個循環(huán)，產(chǎn)物擴增長度為134bp。

1．4 認知功能評價 采用蒙特利爾認知功能評估量表（MoCA）[2]對患者的認知功能進行評價，包括了注意與集中、執(zhí)行功能、記憶、語言、視結構技能、抽象思維、計算和定向力等8個認知領域的11個檢查項目。總分30分，≥26分正常。

1．5 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 16．0版本，滿足正態(tài)分布的計量資料采用（x±s）描述，兩組數(shù)據(jù)比較分析采用t檢驗，數(shù)據(jù)相關性分析采用Pearson線性相關分析法；P值＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 研究組和 對照組 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平、MoCA評分比較 研究組患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平、MoCA評分均顯著的高于對照組（P＜0．05）；見表 1。

2．2 發(fā)作組和非發(fā)作組的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比較 發(fā)作組患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA 評分均顯著的高于非發(fā)作組 （P＜0．05）；見表2。

2．3 發(fā)作的癲 癇患者 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平與發(fā)作嚴重程度關系癲癇發(fā)作組患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平與NHS3評分均呈顯著的正相關關系（P＜0．05）；見表 3。

2．4 癲 癇 患 者 的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平與患者認知損害的關系 90例癲癇患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平與MoCA評分均呈顯著的負相關關系（P＜0．05）；見表 4。

3 討論

遺傳易感因素、自身免疫功能的紊亂及病毒感染等，均可以促進中樞神經(jīng)細胞神經(jīng)元細胞的異常放電，導致癲癇的發(fā)生，特別是在年齡大于35歲具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的患者中，癲癇的發(fā)病率更高，可較普通對照人群上升 3～4倍[1，5]。 臨床上癲癇的發(fā)生嚴重影響到了患者的生活質量和生命安全。一項匯集了119例樣本量的臨床回顧性分析研究顯示，迄今為止臨床上癲癇的總體治療有效率不足45%，且停藥后復發(fā)率較高[6]。而通過對于癲癇發(fā)病過程中相關因子的表達分析研究，可以為癲癇的生物靶向治療或者免疫治療提供新的靶點或者思路。

表 1 兩組 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA評分比較

表 1 兩組 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG 水平、MoCA評分比較

Bax mRNA（相對表達） Caspase-3 mRNA（相對表達） MDA（μmol/L） 8-OHdG（pg/ml） MoCA評分（分）0．78±0．21 0．28±0．10 17．176 0．000 0．76±0．28 0．25±0．10 13．532 0．000 8．46±2．28 5．63±1．59 8．351 0．000 442．6±59．1 316．7±32．8 15．02 0．000 25．1±2．2 26．8±1．7 8．255 0．000組別 n研究組對照組t值P值90 60

表2 發(fā)作與未發(fā)作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比較

表2 發(fā)作與未發(fā)作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平比較

Bax mRNA（相對表達） Caspase-3 mRNA（相對表達） MDA（μmol/L） 8-OHdG（pg/ml）0．97±0．16 0．55±0．18 11．085 0．000 0．92±0．20 0．61±0．24 6．390 0．000 9．21±1．98 7．30±2．14 4．131 0．000 465．5±48．4 392．4±50．0 6．566 0．000發(fā)作情況 n發(fā)作組非發(fā)作組t值P值62 28

表3 發(fā)作患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG與NHS3評分的關系

表4 癲癇患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG與認知功能損害的關系

MDA、8-OHdG在惡性腫瘤、自身免疫性疾病等的發(fā)生過程發(fā)揮了重要的調控作用，同時在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的發(fā)生發(fā)展過程中同樣具有潛在作用[7]。MDA、8-OHdG可以通過影響到下游基因或者蛋白的翻譯和表達，進而導致細胞內信號通路的激活。MDA、8-OHdG可以通過影響到神經(jīng)元鞘膜的完整性，促進神經(jīng)元細胞損傷和異常放電，促進了癲癇病情的進展[8，9]，特別是相關指標對于神經(jīng)鞘膜組織的核糖核苷酸及還原型谷胱甘肽等代謝的影響，能夠誘導氧化應激反應的發(fā)生，促進下游趨化因子如C3、C4的激活，增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫性損傷[10]；Bax mRNA、Caspase-3 mRNA作為基因轉錄水平的改變，能夠通過誘導下游凋亡效應蛋白的翻譯，促進神經(jīng)元細胞的凋亡，破壞神經(jīng)元細胞的生物電傳遞的完整性，增加電活動的同步性[11]。同時Bax mRNA、Caspase-3 mRNA翻譯增強誘導的海馬區(qū)域及大腦皮層組織的多巴胺代謝障礙，能夠增加癲癇大發(fā)作或者部分性發(fā)作的風險。

本次研究通過相關指標的血清學檢查及基因檢測分析可見，癲癇患者的血清中Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG等的表達強度明顯上升，高于正常對照人群，提示不同的指標均可能參與到癲癇患者的生物電活動的異常，促進了癲癇的發(fā)生[12，13]： ⑴Bax mRNA、Caspase-3 mRNA對于下游BAX蛋白或者其他凋亡相關因子的激活，能夠導致神經(jīng)元的程序性凋亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)電傳導完整性的破壞；⑵MDA、8-OHdG對于谷胱甘肽芳基轉移酶或者氨基轉移酶的活性影響，能夠促進神經(jīng)元鞘膜組織的炎癥性損傷，促進神經(jīng)元細胞膜間的電傳導頻率的增強，提高局部神經(jīng)元的異常同步放電的風險。Aanandhi M等[14]學者在探討了73例樣本量的小發(fā)作型癲癇患者的血清學資料，發(fā)現(xiàn)Caspase-3的陽性表達率可平均上升25%以上，同時患者的認知功能越差、行為障礙或者合并有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的人群中，Caspase-3的陽性表達水平可進一步上升。 發(fā)作組患者的 Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平的上升更為明顯，提示急性發(fā)作期患者的體內相關生物學因子的波動較為顯著，考慮可能與下游炎癥因子IL-6或者腫瘤壞死因子α等的激活，通過接觸性抑制神經(jīng)元遞質谷氨酰胺或者磷酸腺苷等的釋放，促進神經(jīng)元軸突末梢間神經(jīng)遞質的傳遞，增加了神經(jīng)元同步放電的風險有關。在探討癲癇患者相關神經(jīng)系統(tǒng)功能改變的過程中發(fā)現(xiàn)，癲癇患者的認知或者中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能評分等與患者體內的凋亡相關基因或者MDA、8-OHdG水平等均密切相關，這考慮可能與凋亡基因的表達轉錄增強，影響到了突觸后膜囊泡運輸機制的異常，并干預到了神經(jīng)元細胞內異常蛋白的沉積，增加了神經(jīng)元細胞的病變及腦膠質成分的代償性改變有關[15]。但部分研究者并未發(fā)現(xiàn)MDA等指標與患者的認知功能的關系，考慮可能與癲癇患者的病程、既往基礎性的治療差異等因素有關。

綜上所述，癲癇患者的Bax mRNA、Caspase-3 mRNA、MDA、8-OHdG水平較正常人群顯著的升高，并且與患者病情嚴重程度、認知損害具有顯著的相關性。