茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

王榮榮，姜興旭，陳龍，朱靜

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000）

茶，被歷朝歷代的養(yǎng)生家、藥學(xué)家稱為“萬(wàn)病之藥”，其藥用價(jià)值的歷史也十分悠久，是被世人公認(rèn)的、天然的功能性飲料。從古至今，我國(guó)人民就有喝茶的良好習(xí)慣。綠茶，是未經(jīng)發(fā)酵而直接制成的茶，其香氣純凈、口感柔和，含有500 多種有機(jī)化合物和26 種以上無(wú)機(jī)礦物質(zhì)，還含有茶多酚、茶多糖和咖啡堿等功能成分和人體必需的蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等，具有抗衰老、防癌、抗菌、抗輻射、消炎等特殊生理作用[1-2]。

茶酒是以茶葉和蔗糖為原料，經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵、過(guò)濾、澄清、陳釀而制成的酒精飲料。茶酒中含有豐富的氨基酸、維生素及茶多酚、咖啡堿等多種營(yíng)養(yǎng)成分，日常適量飲用，可起到健胃生津、醒腦明目、改善代謝紊亂、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效[3-8]。

對(duì)茶酒的研制與我國(guó)酒類研發(fā)的保健方向一致，既增加了市場(chǎng)上的酒類品種，又具有十分廣闊的發(fā)展前景。目前，李國(guó)勝等[9]、周丹丹等[10]、劉銳等[11]對(duì)茶酒發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但并未進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究；李秀萍等[12]、靳夢(mèng)楚等[13]、李雪等[14]、熊亞等[15]對(duì)甘蔗、火龍果、仙人掌果酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了研究，但都僅限于菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗，研究均為酵母在果酒中的動(dòng)力學(xué)。茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)主要是采用數(shù)學(xué)模型來(lái)定量描述在發(fā)酵過(guò)程中的菌體濃度、底物濃度和產(chǎn)物濃度隨時(shí)間變化的規(guī)律，對(duì)于研究發(fā)酵工藝參數(shù)、優(yōu)化和控制過(guò)程操作具有十分重要的意義[16]。在目前的研究中，對(duì)于茶酒動(dòng)力學(xué)尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究以信陽(yáng)毛尖和蔗糖為原料，釀酒酵母為發(fā)酵菌株，對(duì)茶酒發(fā)酵過(guò)程中主要理化指標(biāo)測(cè)定，進(jìn)行茶酒發(fā)酵規(guī)律的研究，并構(gòu)建其動(dòng)力學(xué)模型，從而為優(yōu)質(zhì)茶酒的開發(fā)和研制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

信陽(yáng)毛尖、一級(jí)蔗糖：沃爾瑪超市；果酒專用酵母：安琪酵母股份有限公司；酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（FA2104）：上海良平儀器儀表有限公司；酒精計(jì)（0～100）：河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠；生化培養(yǎng)箱（SPX-250BIII）：北京科偉永興儀器公司；雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pH 計(jì)（STARTER3C）：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

茶酒的制作工藝參考李建芳等[17]，略作調(diào)整。

茶葉與水按 1 ∶50（g/mL）在 90 ℃～95 ℃浸提 30 min，過(guò)濾，冷藏備用。糖度調(diào)整為17°Bx，pH 4.5，酵母接種量0.3%，活化后接種至茶湯中，24 ℃恒溫發(fā)酵13 d，每隔48 h 取樣檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)方法

每隔1 d 測(cè)一次指標(biāo)，每次都在固定時(shí)間取樣，按照相應(yīng)的檢測(cè)方法檢測(cè)不同時(shí)期各個(gè)理化指標(biāo)數(shù)值。以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的理化指標(biāo)為縱坐標(biāo)，繪制出各理化指標(biāo)隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.2.1 酒精度的測(cè)定

參照GB/T15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計(jì)法。

1.2.2.2 總酸的測(cè)定

參照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.3 總糖的測(cè)定

參照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.4 酵母量的測(cè)定

采用干重法[18]：每次取酒液 20 mL，4 000 r/min，離心15 min，棄上清液，然后在恒溫干燥箱中干燥至恒重后稱重。

1.2.2.5 茶多酚的測(cè)定

依據(jù)《市場(chǎng)茶飲料中茶多酚含量的測(cè)定與分析》中的酒石酸亞鐵法[19]。

1.2.2.6 氨基酸的測(cè)定

采用甲醛中和滴定法[20]。

1.3 茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立及差異顯著性分析

試驗(yàn)中做3 組平行試驗(yàn)，取其平均值。菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)模型的建立采用MATLAB 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.1 酵母菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

Logistic 模型是一個(gè)非常典型的S 形曲線方程[21]，同時(shí)也是一個(gè)廣泛應(yīng)用于擬合釀酒酵母生長(zhǎng)的曲線模型，因而適合茶酒中菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的研究。李雪等[14]在仙人掌果酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究中，用此模型擬合酵母菌生長(zhǎng)。方程如下：

上式兩邊積分得：

式中：X 為菌體量，g；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；Xm為最大菌體量，g；X0為初始菌體量，g；t 為發(fā)酵時(shí)間，h。

1.3.2 酒精度生成動(dòng)力學(xué)模型

茶酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌利用酒液中的糖類來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生酒精，酒精生成與酵母菌的生長(zhǎng)屬于生長(zhǎng)“偶聯(lián)型”，也就是說(shuō)隨著酵母菌的生長(zhǎng)而不斷發(fā)酵產(chǎn)生酒精，二者之間的變化應(yīng)該是一致的。在茶酒發(fā)酵初期，酵母菌因需要適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境而生長(zhǎng)速度較慢，在該階段中酒精度的增加也是緩慢的；而隨著酵母菌適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境以后，進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，該階段的酒精含量也隨之呈指數(shù)上升；當(dāng)酵母菌的數(shù)量繁殖到一定程度時(shí)，體系中的基質(zhì)糖分含量減少，菌體會(huì)呈現(xiàn)穩(wěn)定生長(zhǎng)時(shí)，說(shuō)明該體系酒精度也比較恒定，達(dá)到發(fā)酵末期。因此，選用Luedeking-Piret[22-23]模型來(lái)擬合乙醇生成動(dòng)力學(xué)模型，即：

因 a≠0，b=0，模型可簡(jiǎn)化為：

上式兩邊積分得：

式中：a 為生長(zhǎng)偶聯(lián)參數(shù)；t 為發(fā)酵時(shí)間，h；P 為產(chǎn)物酒精度，%vol。

1.3.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

糖類物質(zhì)在茶酒發(fā)酵過(guò)程中，主要是作為碳源，用來(lái)提供酵母菌生長(zhǎng)繁殖所需要的能量。隨著酵母菌的生長(zhǎng)呈現(xiàn)“S”型，體系內(nèi)的糖類被酵母菌不斷地消耗，殘?zhí)橇恳膊粩嘞陆?。本研究將DoseResp 模型應(yīng)用到茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型上，來(lái)對(duì)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)橇窟M(jìn)行擬合。方程式為：

上式兩邊積分得：

式中：S（0）為初始糖濃度，g/L；t 為發(fā)酵時(shí)間，h；M0為菌體細(xì)胞維持相關(guān)常數(shù)；X 為菌體量，g；P 為產(chǎn)物酒精度，%vol；Yx/s為最大細(xì)胞得率系數(shù)；Yp/s為產(chǎn)物得率系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶酒發(fā)酵過(guò)程中總糖的變化

茶酒發(fā)酵過(guò)程中總糖的變化如圖1。

從圖1可以知道，在發(fā)酵初期，由于酵母菌大量生長(zhǎng)繁殖的需要，對(duì)糖的利用率很高，導(dǎo)致降糖速度非?？?。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，降糖速度變慢，主要是由于酒精含量和酸度的不斷增加，均會(huì)在一定程度上影響釀酒酵母的代謝活動(dòng)能力，從而降低了糖的消耗速度。直到總糖不再變化時(shí)，發(fā)酵也幾乎停止，到主發(fā)酵結(jié)束時(shí)總糖含量為7.5 g/L。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中總糖的變化Fig.1 Changes of total sugar consumption during fermentation process

2.2 茶酒發(fā)酵過(guò)程中酒精度的變化

酒精是茶酒的主要成分，它的含量高低，對(duì)酒的風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響。茶酒發(fā)酵過(guò)程中酒精度含量的變化見圖2所示。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中酒精度的變化Fig.2 Changes of alcohol accuracy during fermentation process

根據(jù)圖2可以看出，發(fā)酵前7 d 時(shí)酒精含量增加速度很快，第7 天后酒精含量增加緩慢，可能是因?yàn)椴杈浦械木凭?、茶多酚、咖啡堿在一定程度上對(duì)酵母的代謝有抑制作用。酒精度的變化與酵母菌的生長(zhǎng)曲線相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明二者呈“偶聯(lián)”狀態(tài)。在發(fā)酵后期酒精度幾乎不再增加，表明酵母進(jìn)入衰亡期，發(fā)酵基本停止，酒精度為8.5%vol。

2.3 茶酒發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化

總酸是茶酒發(fā)酵過(guò)程中的一個(gè)重要理化指標(biāo)，它直接影響茶酒的風(fēng)味，口感和品質(zhì)。發(fā)酵液酸度變化主要來(lái)自酵母在生長(zhǎng)、繁殖、代謝活動(dòng)中產(chǎn)酸，隨著酸度的增加也有利于增強(qiáng)茶酒的抑菌作用，避免雜菌污染。茶酒發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化見圖3。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中總酸的變化Fig.3 Changes of total acid during fermentation process

由圖3可知，發(fā)酵前5 d 酸度升高，原因是在發(fā)酵前期酵母菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，第5 天之后，酸度有浮動(dòng)，原因是酒液中的有機(jī)酸可以被酵母利用[24]。

2.4 茶酒發(fā)酵過(guò)程中酵母量的變化

茶酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌數(shù)量的變化直接關(guān)系到茶酒的品質(zhì)。茶酒發(fā)酵過(guò)程中酵母量含量的變化如圖4所示。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中酵母量的變化Fig.4 Changes of the amount of yeast during the fermentation process

由圖4可知，在發(fā)酵前2 d 里酵母菌生長(zhǎng)速度較為緩慢，隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后開始進(jìn)行大量繁殖。第9 天后釀酒酵母細(xì)胞數(shù)量增加變緩，接近發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酵母菌受到酒精和生長(zhǎng)條件惡化的影響開始出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.5 茶酒發(fā)酵過(guò)程中茶多酚的變化

茶多酚是茶酒中的重要功能成分之一，具有抗氧化、抗輻射、解毒等作用[25]。茶酒發(fā)酵過(guò)程中茶多酚含量的變化見圖5。

從圖5可以看出，隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，茶酒里茶多酚的濃度在不斷下降，原因可能是酶促反應(yīng)和氧化反應(yīng)的影響[26]，茶多酚在光照、有氧的條件下會(huì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，形成茶色素類物質(zhì)；尤其在發(fā)酵初期，茶酒中的氧氣含量較高，茶多酚的降低幅度較大[27-28]。隨著茶酒中總酸的增多，使得酶促反應(yīng)和氧化作用減弱，因此在發(fā)酵后期茶酒中茶多酚的含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)茶多酚的濃度為2 902.35 mg/L。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中茶多酚的變化Fig.5 Changes of tea polyphenols in fermentation process

2.6 茶酒發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的變化

氨基酸也是茶酒中的重要功能成分之一，其具有鮮味，跟茶酒的香氣、品質(zhì)和滋味有著非常重要的關(guān)系。茶酒發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化見圖6。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸的變化Fig.6 Changes of amino acids during fermentation process

從圖6可以看出，在發(fā)酵前期游離氨基酸的含量先是迅速上升，隨后又開始下降，在發(fā)酵中期游離氨基酸的含量逐漸下降，最后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵末期茶酒中游離氨基酸的含量為0.002 49 mg/100 mL。

2.7 茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

茶酒發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型主要是研究發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗的關(guān)系，以及這幾個(gè)指標(biāo)與發(fā)酵時(shí)間的聯(lián)系。本試驗(yàn)采用MATLAB 對(duì)茶酒發(fā)酵過(guò)程主要理化指標(biāo)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，建立動(dòng)力學(xué)方程，并采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析，來(lái)探究茶酒發(fā)酵規(guī)律，為優(yōu)質(zhì)茶酒的開發(fā)和研制提供理論基礎(chǔ)。

2.7.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

采用Logistic 經(jīng)典模型對(duì)茶酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的數(shù)目進(jìn)行擬合，得到圖7所示擬合曲線，方差分析結(jié)果如表1所示。

模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的平均擬合誤差為2.32%，模型的 F 值為 390.031，P 值≤0.01，呈現(xiàn)極顯著，表明擬合效果好，說(shuō)明該模型能較好地描述茶酒發(fā)酵過(guò)程酵母菌數(shù)的動(dòng)態(tài)增長(zhǎng)過(guò)程。擬合求解得X0=0.086；μm=0.358，Xm=0.235；并帶入方程得到酵母生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型方程為：

圖7 茶酒發(fā)酵過(guò)程中酵母菌生長(zhǎng)擬合曲線Fig.7 The growth fitting curve of yeast in the process of fermentation

表1 茶酒酵母菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型方差分析表Table 1 Analysis of variance of fermentation kinetic model of yeast

2.7.2 酒精度生成動(dòng)力學(xué)模型

茶酒發(fā)酵過(guò)程中酒精生成量實(shí)際值與擬合曲線如圖8所示，方差分析結(jié)果如表2所示。與圖7對(duì)比可知，酒精的生成與酵母菌的生長(zhǎng)基本同步。模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的平均誤差為3.82%，模型的F 值為1 439.068，P 值≤0.01，呈現(xiàn)極顯著，表示擬合效果良好，說(shuō)明該模型能夠較好地描述茶酒發(fā)酵過(guò)程酒精的動(dòng)態(tài)增長(zhǎng)過(guò)程。根據(jù)不同時(shí)間的酒精含量試驗(yàn)數(shù)據(jù)（P），將公式（8）和 X0帶入公式（5），運(yùn)用軟件進(jìn)行擬合，經(jīng)運(yùn)算得到a=59.438。將運(yùn)算得到的參數(shù)值帶入公式（5），得到茶酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型為：

圖8 茶酒發(fā)酵過(guò)程中酒精生成擬合曲線Fig.8 The fitting curve of alcohol content in the process of fermentation

表2 茶酒酒精生成動(dòng)力學(xué)模型方差分析表Table 2 Analysis of variance of fermentation kinetic model of alcohol content

2.7.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

底物消耗動(dòng)力學(xué)方程擬合采用DoseResp 模型進(jìn)行，得到的擬合曲線如圖9所示，方差分析結(jié)果如表3所示。

圖9 茶酒發(fā)酵過(guò)程中底物消耗擬合曲線Fig.9 The fitting curve of Substrate consumption in the process of fermentation

表3 茶酒底物消耗動(dòng)力學(xué)模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of fermentation kinetic model of substrate consumption

模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的平均擬合誤差為5.53%，模型的F 值為3 182.341，P 值≤0.01，呈現(xiàn)極顯著，說(shuō)明擬合效果較好，表明該模型能夠較好地反映茶酒發(fā)酵過(guò)程中底物消耗的動(dòng)態(tài)變化。擬合求解得1/Yx/s=161.93，1/Yp/s=12.54，M0=11.498；將式（5）帶入式（7），求解參數(shù)一并帶入方程得到底物消耗動(dòng)力學(xué)模型方程為：

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用Logistic 方程、Luedeking-Piret 方程與DoseResp 方程，利用MATLAB 對(duì)茶酒發(fā)酵過(guò)程中的菌體數(shù)目、酒精生成和糖消耗量分別進(jìn)行方程擬合，采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行差異顯著性分析，擬合平均誤差分別為2.32%、3.82%、5.53%，模型的F 值分別為 390.031、1 439.068、3 182.341，P 值均≤0.01，說(shuō)明擬合效果良好，表明所選的方程可以較好地反映茶酒的發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)態(tài)變化。同時(shí)，本次試驗(yàn)在進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)之上，測(cè)定了多種指標(biāo)的變化，如茶多酚和氨基酸等。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，茶酒中總糖含量為7.5 g/L，酒精度為8.5 %vol，游離氨基酸的含量為0.002 49 mg/100 mL，茶多酚的濃度為2 902.35 mg/L。在茶酒發(fā)酵過(guò)程中，總糖和茶多酚的變化趨勢(shì)也與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致[29]，進(jìn)一步驗(yàn)證了茶酒發(fā)酵過(guò)程物質(zhì)變化的規(guī)律。

綜上，茶酒發(fā)酵過(guò)程中主要理化指標(biāo)的變化呈現(xiàn)一定規(guī)律，這也與文獻(xiàn)報(bào)道[24]有所符合，從而為優(yōu)質(zhì)茶酒的研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。茶酒發(fā)酵過(guò)程的機(jī)理較為復(fù)雜，本次僅研究分析了幾種重要的理化指標(biāo)，對(duì)茶酒的生產(chǎn)研發(fā)有一定的指導(dǎo)意義，但要想生產(chǎn)出質(zhì)量上乘的茶酒則需要進(jìn)行更深入的研究。