山葡萄籽油的脂肪酸組成研究

程碧君，李天嬌

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

葡萄為落葉藤本植物，其產(chǎn)量幾乎占全世界水果產(chǎn)量的四分之一。葡萄除鮮食外，主要用于釀酒[1]。我國(guó)釀酒葡萄資源十分豐富，年產(chǎn)葡萄酒110 萬(wàn)噸。釀酒后的葡萄籽大多數(shù)作為廢棄物處理，造成環(huán)境的污染和資源的浪費(fèi)[2]。

由于品種和生長(zhǎng)環(huán)境的差異，葡萄籽的含油率在6%～22%[3]。葡萄籽油營(yíng)養(yǎng)成分豐富，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健功效。CARMEN 等[4]對(duì)葡萄籽油進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)和小鼠遺傳毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，以人體推薦劑量25 倍～100 倍的葡萄籽油喂食小鼠、大鼠，均無(wú)明顯致毒作用。唐春江等[5]報(bào)道了葡萄籽油萃取、純化及脂肪酸組成等基礎(chǔ)研究。并且葡萄籽油作為功能性油脂，在食用油脂的抗氧化方面得到了應(yīng)用[6]。山葡萄為東北地區(qū)常用的釀酒葡萄品種，但是關(guān)于山葡萄籽油的脂肪酸組成方面報(bào)道不多。本文采用石油醚和氯仿/甲醇提取山葡萄籽油，比較兩種有機(jī)溶劑提取的山葡萄籽脂類物質(zhì)的差異，為進(jìn)一步研究山葡萄籽中脂類物質(zhì)組成提供參考，為開(kāi)發(fā)山葡萄籽油提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙優(yōu)山葡萄籽：吉林省吉林市左家葡萄種植園；硅膠G 板：青島海洋化工廠；甲醇、三氯甲烷、正己烷等（均為分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204 電子天平：梅特勒-托利公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；GC/MS-QP2010 氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 山葡萄籽油的提取

參考Yoshida 等[7]的方法，將山葡萄籽粉碎，稱取20 g，加入 100 mL 石油醚或氯仿-甲醇（2 ∶1，體積比）充分?jǐn)嚢? h，靜置后過(guò)濾，重復(fù)提取兩次，合并濾液，減壓濃縮至50 mL 左右，分別加入石油醚或氯仿-甲醇（2 ∶1，體積比）定容至 100 mL，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入20 mL 0.75%氯化鈉溶液，混合，靜置分層。石油醚提取液中上層為有機(jī)相，下層為水相，上層過(guò)無(wú)水硫酸鈉除水，蒸發(fā)濃縮至回收瓶中不再有石油醚流入，濃縮物進(jìn)行稱重，冷凍，待用。氯仿/甲醇提取液中上層為水相，下層為有機(jī)相，下層過(guò)無(wú)水硫酸鈉除水，蒸發(fā)濃縮至回收瓶中不再有氯仿/甲醇流入，濃縮物進(jìn)行稱重，冷凍，待用。

1.3.2 薄層色譜分析

應(yīng)用薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法[8]對(duì)山葡萄籽油定性分析，樣品分別用甲醇配制，濃度均為200 mg/mL，采用硅膠G 板，選用正己烷∶無(wú)水乙醚 ∶乙酸（75 ∶25 ∶2，體積比）為展開(kāi)劑，點(diǎn)樣量 5 μL，展開(kāi)至14 cm 時(shí)結(jié)束，晾干，用碘蒸氣顯色至斑點(diǎn)清晰。同時(shí)，將各脂類成分從薄層板上刮下，用甲醇溶解，離心后濃縮，稱重。

1.3.3 脂肪酸甲酯化

采用寇秀穎[9]硫酸-甲醇甲酯化方法，分別稱取山葡萄籽油提取物100 mg，置于25 mL 具塞試管中，各加入5 mL 1%硫酸-甲醇溶液搖勻，在70 ℃水浴中反應(yīng)30 min，取出冷卻后，再加入2 mL 正己烷，然后加入蒸餾水至25 mL，取上層有機(jī)相層后，水層再加入1 mL正己烷洗滌一次，將上層有機(jī)相層合并，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.3.4 氣相色譜質(zhì)譜儀（gas chromatography mass spectrometr，GC-MS）分析

GC 條件：色譜柱為Rxi-5MS （30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，柱流速為 1mL/min，進(jìn)樣口溫度 280 ℃，分流進(jìn)樣量 1 μL，分流比為 1 ∶50，采用程序升溫：初始 80 ℃，保持 5 min，以 3 ℃/min 升溫至200 ℃，保持 0 min；以 8 ℃/min 升溫至 300 ℃，保持15 min。

MS 條件：電離方式為 EI；離子源溫度 230 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；溶劑延遲為4.5 min；質(zhì)量掃描范圍 m/z35 ～500；檢索庫(kù)為 NIST11.LIB、NIST11s.LIB。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄籽油中脂類成分的組成

石油醚和氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油薄層層析結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 山葡萄籽油TLC 圖Fig.1 TLC profile of mountain grape seed oil

TLC 結(jié)果顯示，甘油三酯是山葡萄籽油的主要成分，氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中的中性脂含量高于石油醚提取的山葡萄籽油中的中性脂含量，石油醚提取的油中不含磷脂，氯仿/甲醇提取的油中含有磷脂，在薄層色譜中未展開(kāi)，Rf 值為0，TLC 結(jié)果與何偉等[10]等一致。

不同溶劑提取的山葡萄籽油中各脂類成分的含量結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同溶劑提取的山葡萄籽油中各脂類成分的含量（±S，n=3）Table 1 Contents of different lipophilic components in mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

表1 不同溶劑提取的山葡萄籽油中各脂類成分的含量（±S，n=3）Table 1 Contents of different lipophilic components in mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

注：-表示未檢出；同行不同字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。

脂類物質(zhì) 含量/%石油醚 氯仿/甲醇甘油三酯 92.61±1.91a 81.61±2.41b中性脂 7.32±2.24a 8.22±1.81a磷脂 - 10.33±0.52

由表1可知，石油醚提取的山葡萄籽油占樣品質(zhì)量的13.5%。其中甘油三酯、中性脂占脂類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為92.61%、7.32%。氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油占樣品質(zhì)量的9.2%。其中甘油三酯、中性脂和磷脂，占脂類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為81.61%、8.22%和10.33%。

石油醚提取的甘油三酯與氯仿/甲醇提取的甘油三酯的含量存在顯著性差異，石油醚提取的山葡萄籽油中的甘油三酯含量為92.61%，比氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中的甘油三酯高出12%，這是由于氯仿/甲醇將山葡萄籽中磷脂類成分提取出來(lái)，造成甘油三酯在山葡萄籽油中含量降低。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚提取的山葡萄籽油得率為13.5%，明顯高于氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油得率9.2%，邊梅娜等[11]以石油醚為溶劑，提取赤霞珠葡萄籽油，油脂提取率為14.83%，與試驗(yàn)結(jié)果大致相同。此外，中性脂在兩種提取物中的含量沒(méi)有顯著性差異，由此推測(cè)，中性脂的含量在山葡萄籽油中的含量為7%左右。磷脂在石油醚提取的山葡萄籽油中未檢出，在氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中的含量為10.33%。

2.2 山葡萄籽油脂肪酸GC-MS分析鑒定結(jié)果

采用GC-MS 對(duì)山葡萄籽油的脂肪酸進(jìn)行分析，總離子流圖如圖2和圖3。檢出的組分經(jīng)NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并進(jìn)行譜圖解析，利用面積歸一化法計(jì)算各組分的百分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 石油醚提取的山葡萄籽油脂肪酸甲酯總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with petroleum ether

圖3 氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油脂肪酸甲酯總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with chloroform/methanol

表2 不同溶劑提取的山葡萄籽油中脂肪酸甲酯質(zhì)譜解析結(jié)果（±S，n=3）Table 2 MS analysis of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

表2 不同溶劑提取的山葡萄籽油中脂肪酸甲酯質(zhì)譜解析結(jié)果（±S，n=3）Table 2 MS analysis of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

序號(hào) 保留時(shí)間/min 化合物 分子式 分子量 相對(duì)百分含量/%石油醚 氯仿/甲醇1 42.444 十六烷酸甲酯 C17H34O2 270 8.17±0.79a 8.6±0.18a 2 47.565 9，12-十八碳二烯酸甲酯 C19H34O2 294 67.22±2.85a 68.43±0.51a 3 47.656 9-十八碳烯酸甲酯 C19H36O2 296 16.37±0.74a 16.29±0.2a 4 47.749 ω-二十三烯酸 C23H44O2 352 1.43±0.25a 1.57±0.06a 5 48.192 十八烷酸甲酯 C19H38O2 298 2.3±0.53a 2.99±0.32a 6 49.461 二十一烷酸甲酯 C22H44O2 340 0.33±0.09a 0.05±0.01b 7 51.277 9-十六碳烯酸甲酯 C17H32O2 268 0.21±0.12a 0.02±0.01b

續(xù)表2 不同溶劑提取的山葡萄籽油中脂肪酸甲酯質(zhì)譜解析結(jié)果（±S，n=3）Continue table 2 MS analysis of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

續(xù)表2 不同溶劑提取的山葡萄籽油中脂肪酸甲酯質(zhì)譜解析結(jié)果（±S，n=3）Continue table 2 MS analysis of methyl-esterfied fatty acids from mountain grape seed oil extracted with different solvents（±S，n=3）

注：不同字母表示組間差異顯著（P＜0.05）。

序號(hào) 保留時(shí)間/min 化合物 分子式 分子量 相對(duì)百分含量/%石油醚 氯仿/甲醇8 51.663 二十烷酸甲酯 C21H42O2 326 0.2±0.08a 0.04±0.01b 9 52.586 13-十七碳烯酸甲酯 C18H34O2 282 0.27±0.06a 0.02±0.01b 10 53.597 9，12-十七碳二烯酸甲酯 C18H32O2 280 0.24±0.08a 0.03±0.01b 11 53.775 順9，10-甲基十九烷酸甲酯 C20H38O2 310 0.17±0.06a 0.02±0.01b 12 53.866 二十一烷酸甲酯 C22H44O2 340 1.2±0.11a 0.19±0.02b 13 53.997 膽甾醇丙酸酯 C30H50O2 442 0.32±0.08a 0.06±0.01b 14 54.045 3-羰基-奧利烯（12）-酸（28）-甲脂 C31H48O3 468 0.22±0.03a 0.07±0.02b

GC-MS 共檢測(cè)出14 種脂肪酸。由表2可知，石油醚和氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中9，12-十八碳二烯酸（亞油酸）相對(duì)百分含量分別為67.22%和68.43%，沒(méi)有顯著差異。9-十八碳烯酸（油酸）的相對(duì)百分含量分別為16.37%和16.29%，沒(méi)有顯著差異。十六烷酸（棕櫚酸）的相對(duì)百分含量分別為8.17%和8.6%，沒(méi)有顯著差異。十八烷酸（硬脂酸）的相對(duì)百分含量分別為2.3%和2.99%，沒(méi)有顯著差異。結(jié)果顯示，石油醚和氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中脂肪酸組成沒(méi)有顯著性差異，山葡萄籽油中不飽和脂肪酸含量超過(guò)83%，飽和脂肪酸含量為10%左右。

李桂華等[12]應(yīng)用氣相色譜法分析葡萄籽油的脂肪酸組成，結(jié)果表明，葡萄籽油中不飽和脂肪酸含量近90%，其中人體必需脂肪酸亞油酸含量達(dá)75.25%，油酸含量為14.09%，與紅花油、葵花籽油的亞油酸含量相近；其中飽和脂肪酸含量為10.7%，棕櫚酸的含量為7.9%，硬脂酸的含量為2.75%。丁旭光等[13]采用GC-MS 分析釀酒山葡萄籽中脂肪酸成分，鑒定出5 種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸3 種，占脂肪酸總量的87.30%，9，12-十八碳二烯酸（亞油酸）占脂肪酸總量的69.58%，9-十八碳烯酸（油酸）占脂肪酸總量的14.90%，研究結(jié)果與本文一致。

3 結(jié)論

石油醚提取的山葡萄籽油由甘油三酯和中性脂組成，未能提取磷脂類物質(zhì)。氯仿/甲醇提取的山葡萄籽油中脂類成分較豐富，這是由于極性的甲醇與非極性的氯仿混合液能有效地提取結(jié)合態(tài)脂類，特別是磷脂成分[14]。而石油醚則易于提取游離態(tài)的脂肪，對(duì)脂蛋白、磷脂等結(jié)合態(tài)的脂類則不能完全提取出來(lái)[15]。

山葡萄籽油中不飽和脂肪酸含量超過(guò)83%，以亞油酸（67 %）和油酸（16 %）為主；飽和脂肪酸含量為10 %左右，分別為棕櫚酸（8%）和硬脂酸（2%）。

眾所周知，不飽和脂肪酸易于人體吸收，具有調(diào)節(jié)血脂、清理血栓、免疫調(diào)節(jié)、維護(hù)視網(wǎng)膜提高視力、補(bǔ)腦健腦、改善關(guān)節(jié)炎癥狀等功效[16]。并且，山葡萄籽油富含亞油酸，亞油酸是人體必需脂肪酸[17]，具有降低膽固醇和降血脂、改善高血壓、預(yù)防心肌梗死、預(yù)防膽固醇造成的膽結(jié)石和動(dòng)脈硬化的作用[18]。

此外，葡萄籽油含有豐富的礦物質(zhì)及維生素[19]。國(guó)外，葡萄籽油已作為保健油和營(yíng)養(yǎng)油使用，還用于高血壓患者的輔助治療及防止腦溢血等。目前，我們僅限于將葡萄籽油作為抗氧化成分應(yīng)用于化妝品中[20]。

綜上所述，山葡萄籽油具有很高的食療價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健功能，開(kāi)發(fā)前景廣闊。本研究為山葡萄籽油的深入開(kāi)發(fā)和綜合利用提供了一定的參考。