響應面法優(yōu)化辣木葉總黃酮提取工藝及其抑菌性研究

馬金魁，黃曉辰，張佳儀，馮潤香

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061）

辣木（Moringa oleifera）為辣木科辣木屬的多年生熱帶植物，栽種遍及亞洲、非洲和中美洲的熱帶及亞熱帶區(qū)域，因其根具有辛辣味，故得名“辣木”[1-2]。在印度、越南及非洲一些國家，辣木的葉、種子、樹皮、根等均是民間傳統(tǒng)藥物，可用于保健和醫(yī)治疾病，故辣木又被譽為“奇跡之樹”[3]。現(xiàn)代研究表明，辣木葉中含充足的蛋白質、維生素和鉀、鈣、鐵等礦質元素，以及黃酮、酚類、有機酸等多種活性物質[4-5]，具有調節(jié)血壓、降血糖、抗氧化、抑菌消炎、抗癌及增強免疫等生理功效[6-7]。我國于20 世紀60年代初將其作為一種藥用植物從緬甸引種栽培，2012年國家衛(wèi)生部將其列為一種新資源食品，2014年成立了中國-古巴辣木科技合作中心[3]。作為一種優(yōu)質的功能性食品原料，隨著其營養(yǎng)及藥用價值被逐步發(fā)現(xiàn)，辣木已成為可持續(xù)農業(yè)和生物綜合利用領域關注的熱點，并在我國云南、兩廣、福建、臺灣等地區(qū)成功種植并逐步實現(xiàn)了產業(yè)化。

黃酮類化合物是辣木葉中重要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，黃酮具有調節(jié)免疫、抗感染、抗衰老、抗腫瘤、防止骨質疏松等生物活性[8]。目前，有關辣木葉黃酮提取工藝和體外抗氧化[9-10]、降糖活性[11-12]已有初步研究。王遠等[12]利用微波輔助提取辣木葉總黃酮的得率為5.53%，且對α-葡萄糖苷酶有較好抑制作用。孫朦等[13]利用乙醇-超聲法提取辣木葉總黃酮的提取率為5.21%，所得黃酮提取物具備較好的自由基清除能力。岳秀潔等[14]研究了乙醇超聲輔助提取辣木葉總黃酮的最佳工藝及其抗氧化性。然而，這些研究中涉及的提取方法提取率不高，且關于辣木葉黃酮抑菌性的研究未見相關報道。

目前，黃酮的提取方法主要包括傳統(tǒng)醇提法、微波輔助萃取法、超聲波輔助提取法、超臨界萃取法等[15]。超聲波輔助提取法可通過超聲波的空化作用促進目標組分的溶出，條件溫和，提取效率高。因而，本研究采用超聲輔助提取辣木葉總黃酮，優(yōu)化其提取工藝，并考查所得黃酮的抑菌性，為充分利用辣木資源，進一步推廣提高其食用、藥用及經濟價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉，產自云南德宏州，新鮮辣木葉經整理、清洗后置于烘箱中，在50 ℃條件下烘干至恒重，粉碎后過80 目篩，干燥樣品粉末于-20 ℃冰箱密封保存，備用。

蘆丁標準品（批號Y19N7S25244）：北京百靈威科技有限公司；瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母提取粉：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇、硝酸鋁：均為分析純，西隴科學股份有限公司。

供試菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色假絲酵母（Candida albicans）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），由肇慶學院生命科學學院微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

DHG-9145A 電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；DS-Y500A 高速多功能粉碎機：上海頂帥電器有限公司；BSA124S-CW 電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；Scientz-IID 超聲波細胞破碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；722S 可見分光光度計：上海精科科學儀器有限公司；TDZ5-WS 低速臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；YXQ-LS-50A 立式壓力蒸汽滅菌鍋：廣州市深化生物技術有限公司；SW-CJ-10U 潔凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉總黃酮的提取工藝

精確稱取1.00 g 辣木葉粉末于50 mL 燒杯中，按一定料液比添加一定體積分數(shù)的乙醇溶液，設置相應的超聲波功率超聲輔助提取一定時間。提取液經離心、抽濾，取上清液，旋轉蒸發(fā)濃縮后測定總黃酮含量。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

按照吳迪等[9]繪制標準曲線的方法，稍作修改。準確稱取10 mg 蘆丁標準品，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL 的蘆丁標準溶液。準確吸取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 蘆丁標準溶液于25 mL 容量瓶內，各移入5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min 后移入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min 后移入4%氫氧化鈉溶液10.0 mL，用60%乙醇定容，搖勻后，靜置15 min；在510 nm 處測定吸光度。以蘆丁濃度作為橫坐標（x），吸光度為縱坐標（y），建立標準曲線的回歸方程y=6.684 5x+0.001 5（R2=0.998 6），在 0～0.04 mg/mL 范圍內線性關系良好。

1.3.3 辣木葉總黃酮含量測定

精確移取1.0 mL 樣品提取液于25 mL 容量瓶中，按1.3.2 中方法測定吸光度，代入線性回歸方程進行計算，得出待測液黃酮的濃度。按照以下公式計算總黃酮的提取率：

式中：C 為提取液的濃度，mg/mL；V 為提取液體積，mL；m 為辣木葉樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 超聲功率對辣木葉總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g 辣木葉粉末，固定乙醇體積分數(shù)為 60%，液料比 30 ∶1 （mL/g），提取時間 30 min，按1.3.3 中方法考察超聲功率為 200、300、400、500、600 W條件下辣木葉總黃酮提取率。

1.3.4.2 液料比對辣木葉總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g 辣木葉粉末，提取功率為300 W，固定乙醇體積分數(shù)為60%，提取時間30 min，按1.3.3中方法考察液料比為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）的條件下辣木葉總黃酮提取率。

1.3.4.3 超聲輔助提取時間對辣木葉總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g 辣木葉粉末，提取功率為300 W，液料比為40 ∶1（mL/g），固定乙醇體積分數(shù)為60%，按1.3.3 中方法考察超聲輔助提取時間為 20、30、40、50、60 min 條件下辣木葉總黃酮提取率。

1.3.4.4 乙醇體積分數(shù)對辣木葉總黃酮提取率的影響

精確稱取1.00 g 辣木葉粉末，提取功率為300 W，液料比為40 ∶1（mL/g），超聲輔助提取時間為40 min，按1.3.3 中方法考察乙醇體積分數(shù)為55 %、60 %、65 %、70%、75%、80%條件下辣木葉總黃酮提取率。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗分析的基礎上，以超聲功率（A）、超聲時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、液料比（D）為自變量，辣木葉總黃酮提取率為響應值，采用Design-Expert 8.0.6 依據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面試驗，優(yōu)化辣木葉總黃酮的提取工藝，試驗設計編碼值及因素見表1。

表1 響應面設計編碼值與因素Table 1 Coding values and factors of response surface design

1.3.6 辣木葉總黃酮抑菌活性的測定

1.3.6.1 菌懸液的準備

采用曹培杰等[16]的方法，選取白色假絲酵母、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為受試菌種，其中細菌的培養(yǎng)利用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，酵母的培養(yǎng)利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。將供試菌種分別進行斜面活化，細菌于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，酵母于28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。分別從斜面挑取菌落頂端轉接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，控制菌懸液濃度近似為106cfu/mL，待用。

1.3.6.2 抑菌圈直徑測定

按照蔣雨等[17]采用的瓊脂擴散法，稍作修改。待滅菌后的固體培養(yǎng)基冷卻至約50 ℃時，每50 mL 培養(yǎng)基加入1 mL 供試菌種的菌懸液，混勻后倒入已放置好無菌干燥牛津杯（每皿4 個）的培養(yǎng)皿中，每皿加入約25 mL 培養(yǎng)基，凝固完全后用無菌鑷子夾取出牛津杯，用移液槍每孔準確吸取150 μL 辣木葉黃酮提取液，以無菌水和60%乙醇作陰性對照。于37 ℃培養(yǎng)24 h（細菌），28 ℃培養(yǎng)48 h（酵母）后取出，測量抑菌圈直徑，操作重復3 次取平均。

1.3.6.3 最低抑菌濃度MIC 測定

按照吳均等[18]采用的二倍稀釋法，稍作修改。將辣木葉提取原液制成系列濃度樣品溶液，與供試菌的液體培養(yǎng)基混合均勻，使其中所含辣木葉總黃酮濃度依次為 0、0.26、0.51、1.03、2.05、4.10 mg/mL，培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌20 min。將滅菌后的培養(yǎng)基倒入平板，待充分凝固后，用移液槍分別吸取100 μL 菌懸液，涂布均勻，37 ℃培養(yǎng) 22 h～24 h（細菌），28 ℃培養(yǎng) 40 h～48 h（酵母、霉菌）后取出，觀察供試菌的生長情況。肉眼觀察未見供試菌生長的辣木葉總黃酮濃度即為該菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲功率對辣木葉總黃酮提取率的影響

超聲功率對辣木葉總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 超聲功率對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency of total flavonoids

如圖1所示，當超聲功率處于較低水平時，隨著功率的增大，辣木葉總黃酮的提取率逐漸提高；當超聲功率為300 W 時，總黃酮提取率達到最大值5.03%，隨后提取率逐步下降。超聲波的機械波動作用和空化效應對細胞壁的破壞作用越大，越有利于黃酮的溶出；而功率過大，則破壞黃酮的結構，從而導致提取率下降[19]。

2.1.2 超聲時間對辣木葉總黃酮提取率的影響

超聲時間對辣木葉總黃酮提取率的影響見圖2。

如圖2所示，隨著超聲時間的延續(xù)，辣木葉總黃酮提取率逐漸增大；當超聲時間為40 min 時，總黃酮提取率達最大值7.15%；持續(xù)延長超聲時間，提取率則逐漸呈下降趨勢。隨著超聲時間的增加，辣木葉細胞破碎程度迅速增大，總黃酮的溶出率逐漸增大；隨著超聲時間的繼續(xù)延長，胞內其他物質溶出進入提取液，影響黃酮的提取效果[20]，且超聲時間越長，超聲波的空化效應過大，部分黃酮結構可能被破壞，也將降低總黃酮提取率[21]。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)對辣木葉總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數(shù)對辣木葉總黃酮提取率的影響見圖3。

圖2 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on extraction efficiency of total flavonoids

圖3 乙醇體積分數(shù)對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

如圖3所示，乙醇體積分數(shù)對辣木葉總黃酮提取率有顯著影響。當乙醇濃度在55%～65%時，隨著濃度持續(xù)增加提取率也隨之增大；當乙醇體積分數(shù)為65%時，黃酮提取率達最大值6.77%；之后，隨著乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，黃酮提取率呈下降趨勢?？赡苡捎谝掖俭w積分數(shù)較低時，水溶性物質大量溶解，影響黃酮的提取，使黃酮提取率偏低；隨著乙醇體積分數(shù)的增加，黃酮與乙醇極性接近，溶出增多，提取率增加；當乙醇體積分數(shù)過高時，溶劑極性減小，部分黃酮苷不能溶解，同時造成脂溶性雜質的溶出[22]，導致總黃酮的提取率降低。

2.1.4 液料比對辣木葉總黃酮提取率的影響

液料比對辣木葉總黃酮提取率的影響見圖4。

如圖4所示，當液料比在 10∶1（mL/g）～40∶1（mL/g）范圍變化時，隨著液料比的增大，辣木葉總黃酮的提取率逐步上升；之后，隨著液料比繼續(xù)增大，總黃酮提取率呈現(xiàn)下降趨勢。當提取溶劑過少時，導致提取液濃度過高，不利于黃酮的充分溶出，使總黃酮提取率總體偏低；逐步提高溶劑用量，在超聲波的作用下，總黃酮得到更大程度的溶解；溶劑過多時，黃酮的溶出已達極限，而其他物質溶解增多，影響了黃酮的提取效果，導致其提取得率下降[23]，且溶劑過多會造成資源浪費并不利于后續(xù)的濃縮。綜合考慮，辣木葉總黃酮提取的較適液料比為 40 ∶1（mL/g）。

圖4 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

2.2 響應面試驗結果

響應面試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.1 回歸方程方差分析

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對響應面試驗數(shù)據進行多元回歸擬合，建立辣木葉總黃酮提取率（Y）與超聲輔助提取各因素變量間的回歸方程：Y=-83.213+0.061A+0.119B+2.455C-0.090D-2.025×10-4AB-4.5×10-4AC+1.4×10-4AD+1.25×10-3BC+5.675×10-3BD+4.8×10-3CD-4.808×10-5A2-5.083×10-3B2-0.019C2-5.808×10-3D2。

表3 響應面試驗方差分析表Table 3 Analysis of the variance of the extraction efficiency of total flavonoids

由方差分析可知，模型p＜0.000 1（極顯著），失擬項 p=0.0801＞0.05（不顯著），相關系數(shù) R2為 0.95，決定系數(shù)RAdj.2為0.90，表明響應面模型擬合度好，可信度高，可用于計算和預測辣木葉總黃酮的提取率。由各變量顯著性水平可看出，各考查因素對辣木葉總黃酮提取率的影響效應次序為：B（超聲時間）＞C（乙醇體積分數(shù)）＞D（液料比）＞A（超聲功率）。其中，一次項 A 和交互項BC 對回歸模型影響不顯著，交互項AD 影響顯著，其余各項對回歸模型影響極顯著。

2.2.2 響應面交互作用分析

響應面圖的陡峭程度和等高線圖的形狀可直觀反映各因素交互作用狀況。

圖5 交互作用對總黃酮率提取率的影響Fig.5 Effects of interaction on extraction efficiency of total flavonoids

從圖5可知，超聲功率和超聲時間、超聲功率和乙醇體積分數(shù)、超聲功率和液料比、超聲時間和液料比、乙醇體積分數(shù)和液料比交互作用曲面圖形狀陡峭，且等高線趨于橢圓形，說明兩兩因素間交互作用顯著[24]。超聲時間和乙醇濃度的交互作用響應面圖形狀相對平緩，且等高線形狀趨于圓形，表明該兩因素交互作用不顯著。該觀察結果與模型方差分析結論一致。

2.2.3 驗證試驗

經過Design-Expert 軟件確定超聲輔助提取辣木葉總黃酮的最佳提取工藝條件：超聲功率400 W、超聲時間34.73 min、乙醇體積分數(shù)65.4 %、料液比41.03∶1（mL/g），辣木葉總黃酮提取率預測值可達7.76%。為方便實際操作，以超聲功率400 W、超聲時間35 min、乙醇體積分數(shù)65%、料液比41 ∶1（mL/g）進行試驗，測得辣木葉總黃酮提取率為7.64%，與理論預測值接近，表明該模型優(yōu)化的提取工藝可信度高，可為辣木葉總黃酮的放大生產提供理論依據。

2.3 辣木葉總黃酮的抑菌活性分析

2.3.1 抑菌性分析

辣木葉黃酮提取液對4 種供試菌均有抑制作用，但抑菌效果在4 種供試菌間有顯著差異。其中，辣木葉總黃酮提取液具對白假絲酵母的抑制作用最強，其次為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，對枯草芽孢桿菌的抑制作用較弱。該結果表明辣木葉總黃酮對供試細菌和酵母均具有顯著的抑菌效果。

表4 辣木葉總黃酮提取液的抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibition zone of total flavonoids extracted from Moringa oleifera leaves

2.3.2 最低抑菌濃度的測定

為進一步考查辣木葉總黃酮提取液的抑菌活性，采用二倍梯度稀釋，將辣木葉總黃酮提取物稀釋成濃度范圍為0.26 mg/mL～4.10 mg/mL 的梯度稀釋液，測定辣木葉總黃酮的MIC 值。結果如表5所示，辣木葉總黃酮提取液對白色假絲酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，其MIC 均為2.05 mg/mL，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱，其MIC 為4.10 mg/mL。

圖6 辣木葉總黃酮抑菌性分析Fig.6 Antibacterial effect of total flavonoids extracted from Moringa oleifera leaves

表5 辣木葉總黃酮的最低抑菌濃度Table 5 The minimum inhibitory concentration of total flavonoids in Moringa oleifera leaves

3 結論

利用超聲波輔助提取辣木葉總黃酮，結合單因素試驗和響應面分析優(yōu)化確定辣木葉總黃酮最佳提取工藝為超聲功率400 W、超聲時間35 min、乙醇體積分數(shù)65%、液料比41 ∶1（mL/g），所得辣木葉總黃酮提取率為7.64%，顯著高于文獻報道的采用乙醇提取[9]（總黃酮得率4.88%）、乙醇超聲波提取[13]（總黃酮得率5.17%）、微波輔助提取[12]（總黃酮得率5.53%），表明本研究優(yōu)化所得工藝條件可對辣木葉總黃酮進行有效提取，具有較好的實際應用價值。

抑菌研究結果表明，優(yōu)化所得工藝條件下提取的辣木葉總黃酮對白色假絲酵母、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌具有不同程度的抑菌作用，其中對白色假絲酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，MIC 為2.05 mg/mL，對枯草芽孢桿菌的抑制作用最弱，MIC 為4.10 mg/mL。該研究彌補了辣木葉總黃酮抑菌性研究的空白，且結果表明辣木葉總黃酮對金黃色葡萄球菌抑菌效果優(yōu)于文獻報道的辣木葉蛋白酶解產物。

本研究應用響應面法優(yōu)化超聲輔助提取辣木葉總黃酮的提取工藝，并考察辣木葉總黃酮的抑菌性，為辣木資源的充分利用及食藥功能的進一步研究提供參考。