果酒中二氧化硫、非酚類和酚類物質(zhì)抗氧化能力的研究

薄慧杰 張愛華 潘 勇 曾令文

（常州大學(xué)城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇常州 213164）

食品添加劑二氧化硫（SO2）是食品和飲料行業(yè)中最常用的抗氧化劑之一。SO2在果酒中主要以游離和結(jié)合這兩種形式存在，兩者的含量之和為總SO2含量。它具有抗氧化、殺菌和防腐能力。

果酒中含有少量非酚類抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸、脫氫抗壞血酸和谷胱甘肽等，具有抗氧化作用?？箟难崾撬袕V泛存在的主要天然抗氧化成分之一?？箟难針O易失去電子和氫離子，形成不穩(wěn)定的中間體化合物脫氫抗壞血酸，所以果酒中含有少量的脫氫抗壞血酸。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，由于半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)，是人體抗氧化系統(tǒng)中極其活躍的抗氧化物質(zhì)。這些非酚類抗氧化物質(zhì)通常和酚類化合物一起存在，在果酒中起抗氧化劑作用。

酚類物質(zhì)是芳香環(huán)上連有多個(gè)或一個(gè)羥基的低分子量有機(jī)化合物，種類繁多，根據(jù)碳環(huán)結(jié)構(gòu)的不同，可將其分為類黃酮和非類黃酮物質(zhì)。總黃酮是指物質(zhì)中各類黃酮化合物的總含量。黃酮類化合物中含有柚皮苷和少量野漆樹苷，具有抗菌消炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、提高抗氧化能力、延緩衰老、調(diào)節(jié)代謝機(jī)能等作用。酚類物質(zhì)對(duì)果酒的抗氧化活性以及顏色和口感的影響至關(guān)重要。

抗氧化能力（AOC）是影響果酒品質(zhì)的一個(gè)重要因素。果酒的氧化褐變嚴(yán)重影響果酒的品質(zhì)，多酚氧化酶（PPO） 和過氧化物酶（POD） 是引起果酒酶促氧化褐變的關(guān)鍵酶。多酚氧化酶是一種含銅氧化酶，可將多酚氧化為醌，醌類物質(zhì)發(fā)生聚合會(huì)產(chǎn)生類黑色素。過氧化物酶可促進(jìn)酚類物質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。通過添加適量抗氧化劑可以抑制果酒的氧化褐變，提高果酒的品質(zhì)。通常在釀造過程中添加SO2作為抗氧化劑。

由于果酒中SO2對(duì)AOC的作用大小尚未確定，需要區(qū)分SO2、非酚類抗氧化物質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)果酒總體抗氧化作用的強(qiáng)弱。酚類物質(zhì)通常對(duì)果酒的抗氧化性有增強(qiáng)作用，因此福林酚（FCR）法測定總酚含量可以作為果酒抗氧化性強(qiáng)弱的一個(gè)指標(biāo)。本研究針對(duì)這一問題進(jìn)行一系列測定，最終分別確定它們對(duì)果酒總抗氧化作用的大小。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

葡萄酒：葡萄品種，白露莎，產(chǎn)于江蘇句容；藍(lán)莓酒：藍(lán)莓產(chǎn)于江蘇省溧水；楊梅酒：楊梅產(chǎn)于江蘇省溧陽市日日春莊園；水蜜桃酒：水蜜桃品種為湖景，產(chǎn)于江蘇省無錫市洛社鎮(zhèn)桃源圣境果園基地；宣木瓜酒：宣木瓜產(chǎn)于安徽省宣城市廣德縣四合鄉(xiāng)；火龍果酒：火龍果購于江蘇省常州市凌家塘市場；本研究使用的果酒全部由常州大學(xué)中澳果酒研發(fā)中心釀造。

參考國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，對(duì)6種果酒中總SO2、游離SO2、pH、滴定酸和酒精度進(jìn)行測定，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，測定結(jié)果見表1。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

無水乙醇，99.7%分析純，常州市潤友商貿(mào)有限公司；酒石酸，食品級(jí)；偏重亞硫酸鉀（PMS），食品級(jí)；福林酚試劑，常州市潤友商貿(mào)有限公司；無水碳酸鈉，99.8%分析純，常州市潤友商貿(mào)有限公司；乙醛，99.5%，5.0 mol/L，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP），常州市潤友商貿(mào)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器

PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；722N分光光度計(jì)，上海儀分科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；LCMS2020液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SO2的測定方法

原理：SO2的測定方法為氧化法，樣品中SO2通過循環(huán)真空泵進(jìn)入接收瓶，然后H2O2和SO2反應(yīng)，生成H2SO4，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液中和滴定H2SO4，計(jì)算SO2的含量。

游離SO2含量測定：調(diào)節(jié)流速為1 L/min，移去雙口接收瓶，通過側(cè)壁加入10 mL，0.3%的H2O2，3-4滴甲基紅—亞甲基藍(lán)混合指示劑，然后滴加0.01 mol/L的NaOH，直至溶液呈現(xiàn)橄欖綠色，并且保持30 s不變色，記下所消耗NaOH體積，計(jì)算游離SO2的含量。

結(jié)合SO2含量測定：連接好接收瓶，給圓底燒瓶加10 mL、25%的H3PO4、用移液管移取20 mL待測酒液至圓底燒瓶，連接裝置，在真空條件下蒸餾樣品，流量1 L/min，反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后取下雙口接收瓶，用0.01 mol/L的NaOH滴定至橄欖綠色，記下所消耗NaOH體積，計(jì)算結(jié)合SO2的含量。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。12.2pH值和滴定酸的測定

取燒杯加入適量待測樣品，使其能浸沒電極，用pH計(jì)電極插入燒杯樣品中，記錄pH值。利用酸堿中和原理，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定樣品中的有機(jī)酸，以pH=8.2為電位滴定終點(diǎn)，由NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積可以計(jì)算出樣品總酸含量。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.2.3 酒精的測定方法

依據(jù)GB5009.225《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中二氧化硫的測定》測定。

1.2.4 果酒抗氧化活性分析方法

1.2.4.1 抗氧化能力的測定

采用福林酚（FCR）方法來測定果酒的抗氧化能力。將0.5 mL樣品與2.5 mL稀釋10倍的FCR混合并使其反應(yīng)5 min，向混合物中加入2 mL75 g/L的NaCO3溶液，混勻，在室溫下反應(yīng)2 h后，測量其在760 nm處的吸光度。使用沒食子酸溶液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量的毫克數(shù)（mgGAE/L）。每個(gè)樣品重復(fù)測量3次。

1.2.4.2 SO2對(duì)果酒的抗氧化增強(qiáng)效應(yīng)

國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定葡萄酒中SO2最大使用量為250 mg/L，過量的SO2不僅影響果酒的品質(zhì)而且會(huì)刺激人體消化道黏膜，長期攝入還會(huì)對(duì)肝臟和腎臟造成損害。將樣品中總SO2含量調(diào)整到22 mg/L～224 mg/L范圍內(nèi)，測定它們?cè)诟鱾€(gè)水平下的總酚含量。為了測出SO2對(duì)果酒抗氧化性的增強(qiáng)效果，在稀釋前用質(zhì)量濃度為1000 mg/L的乙醛對(duì)樣品進(jìn)行處理，游離SO2與乙醛形成醛橋，使SO2含量減少，測定此時(shí)樣品中總酚含量。加入乙醛前后測定的總酚含量差值即為SO2對(duì)果酒的抗氧化增強(qiáng)效應(yīng)。

1.2.4.3 非酚類化合物的抗氧化能力

PVPP分子內(nèi)含有可形成氫鍵的N、O原子，多酚分子中含有至少一個(gè)活性氫，可以與PVPP形成氫鍵。由于PVPP不溶于水，多酚分子就通過氫鍵不斷沉積到PVPP分子鏈上而被除去。參考Bridi的方法使用PVPP對(duì)樣品進(jìn)行3次預(yù)處理以除去酚類化合物，將 PVPP（100 mg） 加入 1 mL酒樣中，攪拌30 s，將樣品在室溫下以13000 r/min離心5 min，取上清液0.7 mL加入70 mgPVPP，攪拌均勻并離心，再取上清液0.5 mL加入50 mg PVPP，攪拌均勻并離心。此時(shí)用FCR方法測定上清液的總酚含量即可表示為非酚類化合物的抗氧化能力。

1.2.4.4 總黃酮含量的測定

使用Bursac等的方法測量總黃酮含量。將0.5 mL不同質(zhì)量濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入2 mL去離子水，0.15 mL5%的NaNO2溶液，混勻靜置5 min，加入0.15 mL 10%的AlCl3溶液，混勻靜置1 min，加入1 mL 1mol/L的NaOH溶液，用去離子水定容至5 mL，混勻。以去離子水為空白對(duì)照，在510 nm的波長下測定吸光度，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定重復(fù)3次。以兒茶素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。取0.5 mL樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法測定樣品的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量。樣品中總黃酮的含量以當(dāng)量的兒茶素質(zhì)量濃度（mgCAE/L） 來表示，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.2.4.5 非酚類抗氧化劑含量的測定

通過高效液相色譜（HPLC）測量非酚類抗氧化劑的含量。HPLC因其高效、高速且高度靈敏性而受到廣泛應(yīng)用。采用楊媛、杜梨梨等的方法，用偏磷酸提取酒樣中的抗壞血酸和脫氫抗壞血酸。使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采用C18色譜柱分離，以甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（pH 3.5） 為流動(dòng)相，在245 nm下檢測。同時(shí)用HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行酒樣中還原型和氧化型谷胱甘肽含量測定的方法，用IntersilODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液 （pH 3.0） 和甲醇 （V∶V=90∶10） 為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，在210 nm下檢測，用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

T檢驗(yàn)是用于小樣本（樣本容量小于30）的2個(gè)平均值差異程度的檢驗(yàn)方法，它使用T分布理論來推斷差異發(fā)生的概率，從而判定2個(gè)平均數(shù)的差異是否顯著。本研究主要用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案（SPASS） 軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)來檢測6種水果中SO2、非酚類抗氧化物質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)果酒總抗氧化性的作用是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與討論

本研究使用FCR方法來評(píng)估SO2、非酚類抗氧化物質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)果酒總體抗氧化性強(qiáng)度的影響。

2.1 不同SO2含量對(duì)果酒總抗氧化能力的影響

針對(duì)白色果酒和紅色果酒，隨著偏重亞硫酸鉀（PMS）添加量的增加，6種果酒和標(biāo)準(zhǔn)樣品中SO2含量也隨之增加，各種果酒中總SO2含量測定結(jié)果見表2。

添加不同含量的PMS于標(biāo)準(zhǔn)樣品和果酒中。由于不同果酒的結(jié)合強(qiáng)度不同，所以呈現(xiàn)出不同水平的總SO2含量（表2），但都控制在22 mg/L～224 mg/L范圍內(nèi)，再使用FCR方法測定不同含量總SO2對(duì)不同果酒的抗氧化特性影響，結(jié)果如圖1、圖2所示。

圖1 不同總SO2含量下測定不同果酒的總酚含量

圖2 不同總SO2含量下測定紅色果酒的總酚含量

圖1和圖2分別顯示的是白色果酒和紅色果酒在不同總SO2含量下的總酚含量。由圖1、圖2可知，總SO2含量在22 mg/L～224 mg/L范圍時(shí)，6種果酒隨著SO2含量的增加，其總酚含量也隨之增加。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=1.385x+87.454、R2=0.9754，y=0.5111x+219.43、R2=0.9806，y=0.6976x+1642.8、R2=0.9942。根據(jù)其線性回歸方程的截距可推算出在不人為添加SO2情況下，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的總酚含量分別為87.45 mgGAE/L、219.43 mg GAE/L和1642.80 mg GAE/L，當(dāng)其總SO2含量為200mg/L時(shí)，其總酚含量為364.45mgGAE/L、321.65 mgGAE/L和1782.32 mgGAE/L。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為 y=5.754x+1164、R2=0.9964，y=0.4766x+966.9、R2=0.9972，y=0.8015x+388.69、R2=0.9926。根據(jù)其線性回歸方程的截距可推算出在不人為添加SO2情況下，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒的總酚含量分別為1164.00 mg GAE/L、966.90 mg GAE/L和407.65mgGAE/L。當(dāng)其總SO2含量為200mg/L時(shí)，其總酚含量為2314.80mgGAE/L、1062.22mgGAE/L和548.99 mgGAE/L。由此SO2對(duì)果酒抗氧化性的增強(qiáng)效應(yīng)得到驗(yàn)證。

表2 不同果酒不同水平下的總SO2含量

2.2 SO2對(duì)果酒總抗氧化能力的影響

Somers和Ziemelis指出添加足夠量的乙醛可以完全結(jié)合存在的游離SO2以防止總酚含量的增加。向樣品中加入1000 mg/L的乙醛可消除SO2的增強(qiáng)效應(yīng)。在室溫下加入乙醛反應(yīng)約30 min后，測定不同總SO2含量下不同果酒的總酚含量，結(jié)果如圖3、圖4。

由圖3、圖4可知，在添加乙醛去除游離SO2后，不管是白色果酒還是紅色果酒，其總酚含量都在減少。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=0.6997x+109.06、R2=0.9614， y=0.3633x+208.88、 R2=0.9889， y=1.9456x+1016.8、R2=0.9743。根據(jù)其線性回歸方程計(jì)算出當(dāng)其總SO2含量為200 mg/L時(shí)，其總酚含量分別為249.00 mg GAE/L、281.54 mg GAE/L和1405.92 mg GAE/L，比其加乙醛之前分別降低了32%、12%和21%。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為y=2.1412x+1345.7、R2=0.9462，y=1.0533x+349、 R2=0.9616，y=0.6788x+370.99、R2=0.979。根據(jù)其線性回歸方程計(jì)算出當(dāng)其總SO2含量為200mg/L時(shí)，其總酚含量分別為 1773.94 mg GAE/L、559.66 mg GAE/L和506.75 mg GAE/L，比其加乙醛之前分別降低了23%、47%和8%。因此可以得出游離SO2對(duì)果酒的總酚含量有促進(jìn)作用，由于總酚含量的增加可促進(jìn)果酒抗氧化能力的增強(qiáng)，所以果酒的抗氧化能力也隨之增強(qiáng)。

圖3 添加乙醛的條件下測定白色果酒的總酚含量

圖4 添加乙醛的條件下測定紅色果酒的總酚含量

2.3 非酚類抗氧化物質(zhì)在果酒中的含量

抗壞血酸存在于許多水果中，并廣泛用作白葡萄酒的防腐劑，且脫氫抗壞血酸是抗壞血酸氧化產(chǎn)物，其本身就是一種抗氧化劑。谷胱甘肽具有解毒作用，可用于藥物，也可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。非酚類抗氧化物質(zhì)在這6種果酒中的含量如下頁表3所示。

通過HPLC外標(biāo)法測得的L-抗壞血酸和谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程分別是y=59656x-50359、R2=0.9991和y=345008x-309288、R2=0.9996。由表3可知，這3種非酚類抗氧化物質(zhì)在不同果酒中含量各不相同，其中谷胱甘肽在這6種果酒中的含量較少，抗壞血酸在果酒中的含量較多且差異比較顯著。在白色果酒中，白葡萄酒的非酚類物質(zhì)含量最高，而在紅色果酒中，藍(lán)莓酒的非酚類物質(zhì)含量最高。

表3 不同果酒的非酚類抗氧化物質(zhì)的含量

2.4 非酚類物質(zhì)對(duì)果酒總抗氧化能力的影響

參考Bridi等的方法用交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP） 將樣品進(jìn)行3次處理，由于PVPP可吸附酚類化合物，所以通過預(yù)先除去酚類物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)非酚類化合物對(duì)果酒總抗氧化強(qiáng)度的測定。加入PVPP后樣品總酚含量如圖5、圖6所示。

圖5 添加PVPP條件下測定白色果酒中的總酚含量

圖6 添加PVPP條件下測定不同果酒的總酚含量

由圖5、圖6可知，當(dāng)除去游離SO2和酚類物質(zhì)后，不管是白色果酒還是紅色果酒，它們的總酚含量都明顯下降。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒的線性回歸方程分別為y=0.0208x+3.834、R2=0.9911，y=0.0759x+21.136、R2=0.9954，y=0.3154x+118.83、R2=0.9963。根據(jù)其線性回歸方程計(jì)算出當(dāng)其總SO2含量為200 mg/L時(shí)，其總酚含量為7.99 mg GAE/L、36.32 mg GAE/L和181.83 mg GAE/L，比其加PVPP之前分別降低了97%、87%和87%。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒的線性回歸方程分別為y=0.0425x+13.64、R2=0.9837，y=0.3663x+96.432、R2=0.9908，y=0.7917x+82.078、R2=0.9945。根據(jù)其線性回歸方程計(jì)算出當(dāng)其總SO2含量為200 mg/L時(shí)，其總酚含量為22.14 mg GAE/L、169.69 mg GAE/L和 240.42 mg.GAE/L，比其加PVPP之前分別降低了99%、70%和53%。由此可證明當(dāng)去除酚類物質(zhì)后，果酒的抗氧化能力明顯減弱。

2.5 酚類物質(zhì)在果酒中的含量

酚類化合物是果酒的主要功能性成分，廣泛存在于水果中。果酒是由這些水果釀造而成，所以果酒中的酚類化合物含量也較豐富。本研究針對(duì)6種果酒進(jìn)行酚類物質(zhì)的測定，結(jié)果見表4。

表4 6種果酒中酚類物質(zhì)的含量

FCR方法測定沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.65x+0.0093、R2=0.9985；總黃酮測定中兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.4843x-0.0036，R2=0.9987。由表4可知，紅色果酒中的酚類物質(zhì)含量比白色果酒中的高，在白色果酒中，宣木瓜的酚類物質(zhì)含量最高，水蜜桃酒次之，白葡萄酒含量最低。在紅色果酒中藍(lán)莓酒的酚類物質(zhì)含量最高，楊梅酒次之，火龍果最少。

2.6 酚類物質(zhì)對(duì)果酒總抗氧化能力的影響

本研究主要是區(qū)分SO2、非酚類抗氧化物質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)果酒總體抗氧化作用大小，用FCR方法分別測定不同處理下果酒的抗氧化能力，結(jié)果見表5。

表5 FCR方法測得的果酒在不同條件下的抗氧化能力

FCR方法為果酒的抗氧化性研究提供了有效的依據(jù)。如果已知特定抗氧化劑的摩爾濃度及其吸光度，可根據(jù)其線性回歸方程y=7.65x+0.0093、R2=0.9985計(jì)算出對(duì)應(yīng)的總酚含量，從而計(jì)算出對(duì)總抗氧化能力的相對(duì)作用。由表5可知，在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的9%、6%和8%，非酚類物質(zhì)分別占總體抗氧化性的6%、10%和8%，總酚物質(zhì)的抗氧化性分別占總體抗氧化性的85%、84%和84%。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚類物質(zhì)分別占總體抗氧化性的31%、34%和28%，總酚物質(zhì)的抗氧化性分別占總體抗氧化性的50%、51%和61%。

3 結(jié) 論

本研究使用FCR方法確定6種果酒中SO2、非酚類抗氧化物質(zhì)和酚類物質(zhì)對(duì)總抗氧化作用的大小。在白色果酒中，白葡萄酒、水蜜桃酒和宣木瓜酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的9%、6%和8%，非酚類物質(zhì)分別占總體抗氧化性的6%、10%和8%，總酚物質(zhì)的抗氧化性分別占總體抗氧化性的85%、84%和84%。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒、楊梅酒和火龍果酒中SO2的抗氧化性分別占總體抗氧化性的19%、15%和11%，主要非酚類物質(zhì)分別占總體抗氧化性的31%、34%和28%，總酚物質(zhì)的抗氧化性分別占總體抗氧化性的50%、51%和61%?？偡宇愇镔|(zhì)對(duì)紅色果酒的抗氧化能力相對(duì)較低，這是由于紅色果酒中非酚類物質(zhì)含量較高。

試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是白色果酒還是紅色果酒，酚類物質(zhì)的抗氧化作用都大于SO2和非酚類抗氧化物質(zhì)的作用。在白色果酒中，宣木瓜酒的抗氧化性最強(qiáng)，水蜜桃酒次之，白葡萄酒最弱。在紅色果酒中，藍(lán)莓酒的抗氧化性最強(qiáng)，楊梅酒次之，火龍果最弱。