徂徠山病死松樹(shù)中線蟲(chóng)的分離及鑒定

高 鋒，趙 濤，陳海燕，王怡霖，劉會(huì)香

（1.山東泰安市徂徠山林場(chǎng)，山東泰安271027； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院，山東泰安271000）

徂徠山地處魯中山區(qū)的中心位置，植被覆蓋率達(dá)到了87.8%,具有重要的生態(tài)價(jià)值[1]。 松林面積達(dá)4400hm2，主要樹(shù)種有油松、赤松、黑松。 目前徂徠山未發(fā)生松材線蟲(chóng)病，但隨著松材線蟲(chóng)病的不斷擴(kuò)散蔓延，傳入徂徠山的風(fēng)險(xiǎn)不斷增加，為確保徂徠山松林資源安全，每年定期開(kāi)展松材線蟲(chóng)病的普查和抽樣檢測(cè)工作，為探究徂徠山松樹(shù)死亡原因，是否與松材線蟲(chóng)或擬松材線蟲(chóng)有關(guān)系，本研究調(diào)查了徂徠山10 個(gè)林區(qū)，采集了969 個(gè)樣品，從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)等方面對(duì)所分離到的線蟲(chóng)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。

擬松材線蟲(chóng)( Bursaphelenchus mucronatus) 屬傘滑刃屬， 在形態(tài)上與引起松樹(shù)萎蔫病( Pine Wild Disease) 的松材線蟲(chóng)（B.xylophilus）極其相似。 早期研究認(rèn)為，擬松材線蟲(chóng)致病力弱，在松樹(shù)受到惡劣環(huán)境的影響或者松樹(shù)被其他有害因子危害造成樹(shù)勢(shì)衰弱時(shí)，才會(huì)加速松樹(shù)枯死[2-4]。 近年來(lái)，我國(guó)部分非松材線蟲(chóng)病發(fā)生區(qū)域也出現(xiàn)了大面積松林死亡，但是在死樹(shù)中并沒(méi)檢測(cè)到松材線蟲(chóng)，卻發(fā)現(xiàn)擬松材線蟲(chóng)[5-6]。 說(shuō)明擬松材線蟲(chóng)對(duì)一些松樹(shù)有較強(qiáng)致病性。 現(xiàn)有研究表明，擬松材線蟲(chóng)致病性存在三類(lèi)分化：第一類(lèi)是強(qiáng)致病力，致死率大于85%；第二類(lèi)是微弱致病力和潛在致病力，在環(huán)境適宜條件下能夠造成比較嚴(yán)重危害；第三類(lèi)是無(wú)致病力[7-8]。 相比松材線蟲(chóng)而言，擬松材線蟲(chóng)分布更為廣泛，徐紅梅等研究發(fā)現(xiàn)， 在某些地區(qū)經(jīng)常是擬松材線蟲(chóng)先出現(xiàn)，之后才有松材線蟲(chóng)出現(xiàn)[9]。

1 材料與方法

1.1 材料

2016-2018年定期在山東省泰安市徂徠山林場(chǎng)10 個(gè)林區(qū)，采集瀕死木，刮除外皮后取木質(zhì)部碎片，共采集969 個(gè)松樹(shù)樣本，帶回室內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 樣品檢測(cè)

采用貝爾曼漏斗法。 吸取收集到的液體50μL，顯微鏡觀察是否有線蟲(chóng)及特征。

1.2.2 線蟲(chóng)鑒定

使用毛細(xì)管，挑取一定數(shù)量待檢線蟲(chóng)在顯微鏡下觀察其形態(tài)，觀察線蟲(chóng)的大小和形態(tài)。 分子鑒定參照趙立榮（2005）所使用的線蟲(chóng)通用引物和松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)特異性引物[10]，然后挑取單條線蟲(chóng)，置于PCR 管中，先液氮浴中1 min，然后85℃水浴2min， 重復(fù)該步驟兩次。 后加入蛋白酶K 2μL，56℃處理15 min 和95℃處理10min。 選用Taq MIX酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物送至北京華大公司測(cè)序。 將測(cè)定的菌株序列提交到NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，確定菌株的分類(lèi)地位。

使用MEGA6 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析， 采用Neighbor joining method。 參比序列及GenBank 分類(lèi)號(hào)為：Bursaphelenchus mucronatus （KF025318.1 、JQ729986.1、JQ729987.1、JF751070.1、JF317235.1、EF446953.1、EU296624.1、AM400247.1、AM400246.1、AY347916.1、AY347915.1、AY347914.1、JQ729985.1、MH923204.1）；Bursaphelenchus xylophilus（MH173065.1、MH173064.1、MH173062.1、MH173061.1、MH173060.1、MH172328.1、MH172326.1 、MH172325.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離線蟲(chóng)的鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)特性

顯微觀察表明，徂徠山松木里面的線蟲(chóng)主要有兩種，一種線蟲(chóng)雌蟲(chóng)尾部呈圓椎形，尾端指狀，有明顯的尾尖突，尾尖突長(zhǎng)度約為3.80-5.71μm（圖1）。角質(zhì)層薄，上面布滿圓形小環(huán)；唇區(qū)高，縊縮明顯；口針基部增大；細(xì)長(zhǎng)的食道腺覆蓋于腸道上方，長(zhǎng)度約為4 個(gè)體寬；神經(jīng)環(huán)緊接在中食道球后方。 初步鑒定了擬松材線蟲(chóng)（圖2）；另一類(lèi)線蟲(chóng)為口針退化，尾尖突細(xì)長(zhǎng)，為腐生線蟲(chóng)（圖3）

圖1 擬松材線蟲(chóng)尾尖突

圖2 擬松材線蟲(chóng)的口針及中食道球

圖3 腐生性線蟲(chóng)形態(tài)特征

2.1.2 分子鑒定

圖4 PCR 擴(kuò)增的結(jié)果，M 為DM5000 maker，1、2 為擬松材線蟲(chóng)

對(duì)多批次的線蟲(chóng)樣品進(jìn)行總DNA 提取， 按照松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，其PCR 產(chǎn)物大小約為250bp （圖4） 產(chǎn)物序列測(cè)定和 Blast 分析對(duì)比。 其均為擬松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus mucronatus）。 基于ITS 序列的聚類(lèi)分析也表明它們與擬松材線蟲(chóng)聚在一起（圖5）。綜合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)特征，確認(rèn)送檢的線蟲(chóng)均為擬松材線蟲(chóng)。

圖5 所檢測(cè)樣品ITS 的NJ 系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 松木樣品檢測(cè)

徂徠山各林區(qū)松木樣品送檢檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

通過(guò)表1 可以看出， 徂徠山的10 個(gè)林區(qū)均發(fā)現(xiàn)了死亡的松樹(shù)，其中茶石峪林區(qū)和徂徠林區(qū)所發(fā)現(xiàn)的死亡松樹(shù)最多， 太平頂景區(qū)和上池植物園最少。 所發(fā)現(xiàn)死亡松樹(shù)的主要樹(shù)種為赤松， 占比達(dá)88.5%，其次為黑松占比為11.5%。 在所有死亡的松樹(shù)樣品中，存在大量藍(lán)變現(xiàn)象，藍(lán)變率為73.1%，樣品中檢測(cè)到了大量線蟲(chóng)，線蟲(chóng)的檢出率為63.2%，其中擬松材線蟲(chóng)檢出率為54.5%， 腐生性線蟲(chóng)檢出率為8.7%；在不同樹(shù)種的樣品中，58.0%的赤松樣品中檢測(cè)到了擬松材線蟲(chóng)，27.0%的黑松樣品中檢測(cè)到了擬松材線蟲(chóng)， 說(shuō)明赤松對(duì)擬松材線蟲(chóng)對(duì)更為敏感。

3 結(jié)論與討論

3.1 本研究調(diào)查了徂徠山10 個(gè)林區(qū)， 采集了969個(gè)樣品，從線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)、分子序列測(cè)定方面進(jìn)行了鑒定和測(cè)定。 研究顯示，在徂徠山衰弱、病死木中發(fā)現(xiàn)了大量的擬松材線蟲(chóng)（Bursaphelenchus mucrona-tus）和腐生性線蟲(chóng)。

表1 徂徠山不同林區(qū)松木樣品檢測(cè)結(jié)果

3.2 此前的報(bào)道中，擬松材線蟲(chóng)對(duì)赤松（Pinus densiflora Sieb. et Zucc）、黃山松（Pinustaiwanensis hayata）和黑松（P. thunbergiiparl）、云南松（P.yunnanensis faranch）、思茅松（P. kesiya royle ex gordon var.langbianen）和高山松（P.densata）等的危害均有報(bào)道，常導(dǎo)致很多松林被毀[11-14]。 之前的一些報(bào)道中將擬松材線蟲(chóng)的致病力分為3 種:致病力很強(qiáng),致死率大于85%的種群、較強(qiáng)的致病潛能的,在環(huán)境適宜的情況下可能造成嚴(yán)重危害的種群和幾乎沒(méi)有致病力的種群[7-8]。 徂徠山10 個(gè)林區(qū)松樹(shù)死亡情況存在差異，茶石峪林區(qū)林區(qū)和徂徠林區(qū)所發(fā)現(xiàn)的衰弱和死亡松樹(shù)最多， 太平頂景區(qū)和上池植物園最少，赤松死亡現(xiàn)象嚴(yán)重，占到了總調(diào)查數(shù)量的88.5%，黑松次之，黑松僅占到了11.5%，赤松上藍(lán)變現(xiàn)象明顯，擬松材線蟲(chóng)數(shù)量大，而黑松藍(lán)變現(xiàn)象不明顯，擬松材線蟲(chóng)數(shù)量少，說(shuō)明徂徠山松樹(shù)上的擬松材線蟲(chóng)與松樹(shù)品種關(guān)系密切，是赤松死亡的主要原因，而黑松死亡可能與其它因素有關(guān)。

3.3 藍(lán)變菌是指那些能把樹(shù)木木質(zhì)部染成藍(lán)色或者藍(lán)黑色的真菌類(lèi)群，大多數(shù)藍(lán)變菌都屬于長(zhǎng)嚎殼類(lèi)真菌。 有相關(guān)的研究表明，藍(lán)變菌和松材線蟲(chóng)一起隨媒介昆蟲(chóng)侵入健康的松樹(shù)體內(nèi), 感病松樹(shù)出現(xiàn)異常后,藍(lán)變菌會(huì)在樹(shù)干中從上向下擴(kuò)散。木材有無(wú)藍(lán)變現(xiàn)象也是判斷松木是否感染松材線蟲(chóng)的一個(gè)重要指標(biāo)。同時(shí)藍(lán)變菌是松材線蟲(chóng)最好的食物,對(duì)松材線蟲(chóng)的快速繁殖起一定作用[15]。 本試驗(yàn)采集了大量的松木樣品，發(fā)現(xiàn)了大量的藍(lán)變的松木，但是在藍(lán)變的松木中卻并沒(méi)有檢測(cè)到松材線蟲(chóng)。 藍(lán)變的松木樣品中檢測(cè)到了擬松材線蟲(chóng)，說(shuō)明藍(lán)變菌也與擬松材線蟲(chóng)有著密切的關(guān)聯(lián)，它們之間的關(guān)系還有待下一步探究。 另外在線蟲(chóng)檢測(cè)中還發(fā)現(xiàn)有死亡松樹(shù)木材中有變紅現(xiàn)象，具體由哪一類(lèi)病原引起有待進(jìn)一步研究。