一株β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌的鑒定及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

丁長(zhǎng)河，張夢(mèng)涵

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院 河南省天然色素制備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的典型代表，主要有全反式、9-順式、13-順式及15-順式4種形式。大量研究表明，β-胡蘿卜素能轉(zhuǎn)化為維生素A，具有抗氧化、預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病、提高免疫系統(tǒng)等功能[1-3]。β-胡蘿卜素的主要來(lái)源有天然物提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法。天然物提取法受產(chǎn)品原料、氣候、運(yùn)輸條件的制約，成本高，產(chǎn)量較低；化學(xué)合成法存在一定的危害。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法易培養(yǎng)，產(chǎn)量高，產(chǎn)品具有順式和反式混合體，更加安全，因此得到廣泛的應(yīng)用[4-6]。

產(chǎn)β-胡蘿卜素的微生物主要有三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）[7]、粗壯脈紋孢菌（Neurospora crassa）[8]、紅酵母（Rhodotorula）[9-10]、膠紅酵母（Rhodotorula mucilagi nosa）[11]、鹽藻類等[12-13]。HE Z J等[14]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯能夠?qū)е氯人嵫h(huán)代謝流的下降和乙酰輔酶A的積累，以及甲羥戊酸途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)三孢布拉氏霉菌合成β-胡蘿卜素；向夢(mèng)雄等[15]研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Zn2+或Mn2+對(duì)Blakeslea trispora合成β-胡蘿卜素有促進(jìn)作用，而不同濃度的Fe3+、Cu2+和Ca2+對(duì)β-胡蘿卜素合成存在抑制作用；樊竹青等[16]從云南撫仙湖湖水中分離出379株酵母菌，研究發(fā)現(xiàn)“紅色酵母”具有較強(qiáng)的產(chǎn)類胡蘿卜素的能力；孔維寶等[17]從土壤中篩選出一株產(chǎn)類胡蘿卜素的膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）K-1，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，總類胡蘿卜素含量達(dá)（180.14±2.45）μg/g干菌體，具有高產(chǎn)類胡蘿卜素的潛能；BUZZINI P等[18]研究發(fā)現(xiàn)，Al3+和Zn2+對(duì)牧草紅酵母（Rhodotorula graminis）合成β-胡蘿卜素和γ-胡蘿卜素有促進(jìn)作用，而Zn2+和Mn2+對(duì)紅酵母烯和紅酵母紅素產(chǎn)生了抑制作用。

目前，能產(chǎn)高純度β-胡蘿卜素的菌種還十分有限，合成高純度β-胡蘿卜素的菌株選育仍然是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向之一。本研究以前期從土壤中分離得到的一株高產(chǎn)高純度β-胡蘿卜素的菌株S3-1為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定，并通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)高純度β-胡蘿卜素提供工藝參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株S3-1：本實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中分離、純化并保藏。

1.1.2試劑

酵母浸粉、蛋白胨、麥芽糖（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿：上海方畦儀器有限公司；β-胡蘿卜素（純度≥95%）：德國(guó)Sigma公司；Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

活化培養(yǎng)基：含0.1 g/L氯霉素的PDA培養(yǎng)基，pH自然，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、無(wú)水氯化鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L，pH自然，115℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004W電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；EL20-K pH計(jì)：美國(guó)梅特勒托利多公司；LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHZ-2A數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器：金壇華峰儀器有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDZ7-WS離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株S3-1的鑒定

按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株S3-1的基因組，以其為模板，采用真菌核糖體ITS基因片段的通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板基因組0.5 μL，10×Buffer（含20 mmol/L Mg2+）0.5 μL，2.5mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，rTaq酶（5 U/μL）0.2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各取0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共循環(huán)30次；72℃再延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnologyinformation，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展值為1 000。

1.3.2 菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化

菌株活化：將菌株S3-1劃線于活化培養(yǎng)基，28℃倒置培養(yǎng)3 d。種子培養(yǎng)：挑取活化培養(yǎng)基上的單菌落接種于裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。發(fā)酵培養(yǎng)：按6%（V/V）的接種量將種子液接種于裝液量為40 mL/250 mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min條件下培養(yǎng)84 h。參考楊文等[19]的方法，采用酸熱法進(jìn)行破壁，丙酮進(jìn)行提取，提取至菌體變白，合并提取液，提取過(guò)程盡量避光。

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別考察碳源種類（葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油）及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、氮源種類（酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、酵母浸粉+蛋白胨）及添加量（10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L、60 g/L）、硫酸鎂添加量（0、0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L）、初始pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）對(duì)菌體生長(zhǎng)和β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。根據(jù)β-胡蘿卜素的產(chǎn)量和純度篩選影響顯著的因子和最佳水平，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of fermentation process of β-carotene production by strain S3-1

1.3.3 測(cè)定方法

生物量的測(cè)定：發(fā)酵液經(jīng)離心、水洗后，105℃烘干至恒質(zhì)量，稱菌體質(zhì)量，以g/L表示。

β-胡蘿卜素含量的測(cè)定：參考魏娜等[20]的方法，采用高效液相色譜法對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行定性定量分析。HPLC條件：檢測(cè)波長(zhǎng)454nm，柱溫28℃，流動(dòng)相A是體積分?jǐn)?shù)90%乙腈，B是體積分?jǐn)?shù)100%乙酸乙酯。梯度洗脫：0～5 min，B從0升至50%；5.01min，B升至53%；5.01～10 min，B保持53%；10～15.01 min，B升至54%；15.01～20 min，B降至0。

β-胡蘿卜素純度的測(cè)定[20]：通過(guò)峰面積對(duì)其他色素定量，并計(jì)算β-胡蘿卜素所占比例。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用MSExcel2016進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用SPSS24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析；采用Duncan法進(jìn)行組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株S3-1的鑒定

菌株S3-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物堿基長(zhǎng)度約為574 bp，與目的基因堿基長(zhǎng)度相符，進(jìn)行測(cè)序。

圖1 菌株S3-1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of strain S3-1

將菌株S3-1的ITS測(cè)序結(jié)果提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的ITS基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株S3-1與近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）JQ2-1聚于一支，親緣關(guān)系最近，因此，鑒定菌株S3-1為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。韓梅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，S.pararoseus所產(chǎn)的β-胡蘿卜素以全反式結(jié)構(gòu)為主，全反式結(jié)構(gòu)約占總β-胡蘿卜素的60%，順式結(jié)構(gòu)主要有13-順和9-順β-胡蘿卜素。

圖2 基于ITS基因序列菌株S3-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain S3-1 based on ITS gene sequences

2.3 菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.3.1 碳源種類對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

不同微生物對(duì)碳源的需求不同，不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生不同的作用。因此，比較8種不同碳源對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，當(dāng)以蔗糖為碳源時(shí)，生物量最高，為（13.21±0.08）g/L，與葡萄糖、果糖、可溶性淀粉無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于乳糖、麥芽糖、甘油（P＜0.05）；當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量及純度最大（P＜0.05），分別為（1.95±0.26）mg/L、（53.91±1.47）%。因此，選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

表2 碳源種類對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 2 Effect of carbon sources types on β-carotene production by strain S3-1

2.3.2 葡萄糖添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

研究葡萄糖添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，當(dāng)葡萄糖添加量為40 g/L時(shí)，生物量最高，為（15.10±1.19）g/L；當(dāng)葡萄糖添加量為30 g/L時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量及純度達(dá)到最高，分別為（2.17±0.35）mg/L、（54.80±1.45）%。因此，確定葡萄糖的最佳添加量為30 g/L。

表3 葡萄糖添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 3 Effect of glucose addition on β-carotene production by strain S3-1

2.3.3 氮源種類對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

微生物利用氮元素在細(xì)胞內(nèi)合成氨基酸和堿基，進(jìn)而合成蛋白質(zhì)、核酸等細(xì)胞成分，以及含氮的代謝產(chǎn)物，對(duì)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的意義[22]。有機(jī)氮源中營(yíng)養(yǎng)比較豐富，除了含有一定比例的蛋白質(zhì)、多肽及游離氨基酸外，還含有少量的糖類、脂類、維生素及微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分[22]。由于微生物可以直接從培養(yǎng)基中獲得這些營(yíng)養(yǎng)成分，所以有機(jī)氮源更有利于微生物的生長(zhǎng)。研究不同有機(jī)氮源對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，當(dāng)10g/L酵母浸粉和20 g/L蛋白胨作為氮源時(shí)，生物量最高，達(dá)到（14.49±0.32）g/L；當(dāng)30 g/L酵母浸粉作為氮源時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量和純度最高，分別為（2.62±0.06）mg/L、（60.41±2.62）%。因此，選擇酵母浸粉作為最優(yōu)氮源。

表4 有機(jī)氮源種類對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 4 Effect of organic nitrogen source types on the β-carotene production by strain S3-1

2.3.4 酵母浸粉添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

研究酵母浸粉添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，當(dāng)酵母浸粉添加量在10～60g/L范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量隨著酵母浸粉添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)酵母浸粉添加量為20 g/L時(shí)，菌株S3-1的生物量、β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，分別為（14.32±0.25）g/L、（2.01±0.21）mg/L，且顯著高于其他添加量（P＜0.05）。因此，確定酵母浸粉最佳添加量為20 g/L。

表5 酵母浸粉添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 5 Effect of yeast extract addition on β-carotene production by strain S3-1

2.3.5 硫酸鎂添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

表6 硫酸鎂添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 6 Effect of MgSO4addition on the β-carotene production by strain S3-1

MgSO4提供Mg2+，Mg2+是重要的輔酶和很多酶的激活劑，也是細(xì)胞色素的成分[22]。研究MgSO4添加量對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，當(dāng)MgSO4添加量為1.2 g/L時(shí)，菌體生物量最大，為（16.12±0.18）g/L；當(dāng)MgSO4添加量為0.3 g/L時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為（1.85±0.19）mg/L。因此，確定MgSO4最佳添加量為0.3 g/L。

2.3.6 初始pH值對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響

初始pH值對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，當(dāng)初始pH值為5.0時(shí)，β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高，為（2.36±0.24）mg/L。當(dāng)初始pH值為5.5時(shí)，生物量最高，但與初始pH 5.0無(wú)明顯差異（P＞0.05）。LUO H等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始pH值在4.0～7.0范圍內(nèi)，初始pH值較高的培養(yǎng)基有利于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）細(xì)胞生長(zhǎng)，而相對(duì)較低的初始pH值有利于β-胡蘿卜素的形成。

表7 初始pH值對(duì)菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的影響Table 7 Effect of initial pH on β-carotene production by strain S3-1

2.4 菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量（A）、酵母浸粉添加量（B）、初始pH值（C）及MgSO4添加量（D）為考察因素，β-胡蘿卜素產(chǎn)量、純度為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表8，方差分析見(jiàn)表9和表10。

表8 菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8 Results and analysis orthogonal experiments of optimization of fermentation process of β-carotene production by strain S3-1

續(xù)表

試驗(yàn)號(hào) A B C D β-胡蘿卜素產(chǎn)量/（mg·L-1） 純度/%產(chǎn)量K1 K2 K3 R1 1.973 2.657 2.808 0.835 2.388 2.432 2.618 0.230 2.469 2.446 2.523 0.077最優(yōu)組合純度K1 K2 K3 R1 36.497 52.493 58.117 21.620 48.943 51.213 46.950 4.263 49.437 48.500 49.170 0.937最優(yōu)組合2.206 2.511 2.721 0.515 A3B3C3D3 47.410 50.397 49.300 2.987 A2B3C2D1

表9 以β-胡蘿卜素產(chǎn)量為考察指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiments results using β-carotene production as evaluation index

表10 以β-胡蘿卜素純度為考察指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 10 Variance analysis of orthogonal experiments results using β-carotene purity as evaluation index

由表8可知，影響β-胡蘿卜素產(chǎn)量的因素主次順序?yàn)榻湍附郏酒咸烟牵境跏紁H值＞MgSO4，最佳組合為A3B3C3D3，即葡萄糖40 g/L、酵母浸粉添加量30 g/L、初始pH值5.5、MgSO4添加量0.4 g/L；而影響純度的因素主次順序?yàn)榻湍附郏境跏紁H值＞葡萄糖＞MgSO4，最佳組合為A2B3C2D1，即葡萄糖添加量30 g/L、酵母浸粉添加量30 g/L、初始pH值5.0、MgSO4添加量0.2 g/L。

由表9可知，酵母浸粉對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01），葡萄糖對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。由表10可知，酵母浸粉、葡萄糖和初始pH值對(duì)β-胡蘿卜素純度的影響均為極顯著（P＜0.01），其中酵母浸粉影響最大，其次為初始pH值，最后是葡萄糖。

采用綜合平衡法[24]進(jìn)行多指標(biāo)影響分析，獲得能兼顧β-胡蘿卜素產(chǎn)量和純度兩個(gè)指標(biāo)均衡的優(yōu)化方案。由此分析：首先酵母浸粉（B）對(duì)β-胡蘿卜素純度和產(chǎn)量的影響最大，且均以B3水平最好，因此確定B3為最優(yōu)水平。葡萄糖（A）對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響大小排第二位，且以A3水平最好，對(duì)β-胡蘿卜素純度的影響排第三位，且以A2水平最好，但取A2時(shí)，產(chǎn)量比A3減小了7.7%，因此確定A3為最優(yōu)水平。初始pH值（C）對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響大小排第三位，且以C3水平最好，但對(duì)β-胡蘿卜素純度的影響排第二位，且以C2水平最好，因此，確定C2為最優(yōu)水平。硫酸鎂（D）對(duì)β-胡蘿卜素產(chǎn)量和純度的影響均最小，分別以D3和D1水平最好。因此，對(duì)A3B3C2D1和A3B3C2D3組合進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，組合A3B3C2D1的生物量、β-胡蘿卜素產(chǎn)量和純度均較高，分別為21.03 g/L、3.08 mg/L、60.01%，生物量、β-胡蘿卜素產(chǎn)量較未優(yōu)化前分別提高了75.94%、43.44%。因此，確定菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵工藝為A3B3C2D1。

3 結(jié)論

本研究以土壤中篩選出的一株高產(chǎn)高純度β-胡蘿卜素的菌株S3-1為研究對(duì)象，采用分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為近玫色鎖擲孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）。通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化確定菌株S3-1產(chǎn)β-胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵工藝：葡萄糖40 g/L、酵母浸粉30 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、無(wú)水氯化鈣0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8 g/L、初始pH值5.0。在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，β-胡蘿卜素產(chǎn)量為（3.08±0.46）mg/L，純度為（60.01±2.66）%。