不同生產(chǎn)環(huán)境對特香型大曲的影響

劉 婷，陳可丹，黃冰靜，陳 妍，皮瀟文，萬 茵，劉成梅，付桂明*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；

2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330047；

3.江西省樟樹市樟樹貢酒業(yè)有限公司，江西 樟樹 331200）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，也是世界上消費量最大的含酒精飲品之一[1]。其是以高粱、大米等作為主要原料，大曲、小曲或麩曲作為釀酒的糖化劑，經(jīng)蒸煮、糖化和液化、發(fā)酵、蒸餾而制成的蒸餾酒[2]。大曲是以大麥、小麥、豌豆等為原料，經(jīng)過粉碎，加水混捏，制成形狀較大且含有多種生物酶和菌類的曲塊[3]，是名優(yōu)白酒生產(chǎn)中糖化劑和釀造微生物的主要來源之一。白酒釀造用曲量大，制成的白酒有特殊的曲香，對白酒風(fēng)味形成具有非常重要的作用。俗話說“有美酒必備佳曲”、“曲為酒之骨”[4]。

特香型白酒為我國10大香型白酒之一，其是采用獨特紅條石窖池踩糟發(fā)酵工藝，生產(chǎn)的富含以丙酸乙酯為主的奇數(shù)碳脂肪酸乙酯的特有香型白酒。特香型白酒生產(chǎn)企業(yè)，大多在江西省贛江中下游沿岸天然濕潤環(huán)境地區(qū)制曲，并釀造出優(yōu)質(zhì)特香型白酒，與其特殊地理、氣候環(huán)境下所特有的微生物種類密不可分。特香型大曲生產(chǎn)工藝為以面粉、麥麩為主要原料，其獨具特色的配料方式是添加一定比例的酒糟以提高大曲的酸度[5]，選擇性的讓環(huán)境中耐酸微生物在大曲上生長，生產(chǎn)出一種特有的中高溫大曲。目前對特香型大曲的研究主要集中于微生物的分離和對大曲質(zhì)量的分析，而生產(chǎn)環(huán)境對特香型大曲的影響鮮見相關(guān)報道。

目前，用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究的微生物分子生態(tài)學(xué)方法主要有核酸探針雜交技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gelelectrophoresis，TGGE）、實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，Q-PCR）技術(shù)、限制性片段長度多肽性（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）分析、末端標(biāo)記限制性片段長度多態(tài)性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrand conformationpolymorphism，SSCP）分析、隨機擴增多態(tài)性脫氧核糖核酸標(biāo)記（randomly amplified polymorphic deoxyri bonucleicacid，RAPD）分析和下一代測序（nextgenerationsequencing，NGS）[6]。近年來，下一代測序因其成本低、測序通量高、速度快等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于白酒大曲[7]、酒醅[8]和窖泥[9]的研究中。

本實驗研究了贛江邊和市區(qū)不同生產(chǎn)環(huán)境下，采用相同特香型大曲生產(chǎn)工藝與配料制造的兩種大曲的理化特性、揮發(fā)性成分及微生物組成的差異，并探討制曲環(huán)境對大曲中微生物種類及組成和各種酶活力等關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的影響規(guī)律，以期為特香型大曲標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品：分別來自于江西省贛江流域兩個采用相同的特香型白酒大曲配料和工藝制曲的曲房，A樣品大曲取自于贛江邊濕潤環(huán)境曲房，B樣品大曲取自市區(qū)曲房。

氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、葡萄糖、氯化鈣、3,5-二硝基水楊酸、乙酸鈉、碘、碘化鉀、可溶性淀粉、三氯乙酸、氫氧化鉀等（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；冰乙酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；正構(gòu)烷烴：美國Sigma公司；4-甲基-2-戊醇：德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；固相微萃取手動進樣柄、DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）萃取頭：美國Supelco公司；Agilent7890/7000A三重串聯(lián)四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 特香型大曲制備

以面粉、麥麩為主要原料，添加一定比例的酒糟以提高大曲的酸度，具體配比為麥麩（40%～50%）、面粉（40%～35%）、酒糟（20%～15%）。制成的曲坯入曲房自然接種發(fā)酵，發(fā)酵周期一般為30～35 d，期間經(jīng)過多次翻曲和并房，當(dāng)水分＜15%即可出房，于曲庫室溫放置3個月即得到成品曲。

1.3.2 大曲樣品的處理

選取A、B曲房中成熟的大曲，采樣時間為2017年12月。為確保取樣具有科學(xué)依據(jù)和代表性，從曲房上部、中部和下部各隨機抽取一塊曲，將樣品粉碎并通過四分法混合均勻作為一個樣品。取一部分樣品儲存于-80℃用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析，其余樣品儲存于4℃用于大曲其他性質(zhì)的分析。

1.3.3 特香型大曲理化指標(biāo)測定方法

水分含量、酸度、淀粉含量、酯化力、發(fā)酵力的測定參照參考文獻[3]和QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用方法》[10]。還原糖含量、糖化酶活力測定方法參照文獻[11-12]稍作改動。用Yoo改良法[13]測定液化酶活力。糖化酶活力定義：1g絕干曲在40℃、pH4.6條件下，1 h分解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖，為1個酶活力單位（U/g）。液化酶活力定義：1 g絕干曲在40℃、pH6.0條件下，5 min液化1 mg可溶性淀粉，稱為1個酶活力單位（U/g）。蛋白酶活力定義：1 g絕干曲在40℃下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生l μg酪氨酸，定義為1個酶活力單位（U/g）。

1.3.4 特香型大曲揮發(fā)性成分分析

樣品預(yù)處理：大曲樣品預(yù)處理參照文獻[14-15]。

固相微萃取操作：取5mL上清液，按0.2g/mL的質(zhì)量濃度加入NaCl，再添加10μL4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)溶液（10μg/mL），50℃平衡30 min。將固相微萃取萃取頭（DVB-CAR-PDMS）插到頂空瓶中的頂空部分，萃取30 min；萃取結(jié)束后，插入氣相進樣口熱解吸5 min后分析檢測，采集數(shù)據(jù)。每個樣品平行測定3次。

氣相色譜條件：HP-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為氦氣（He）；流速1 mL/min；分流比10∶1；進樣口溫度250℃；升溫程序為40℃保持1 min，2℃/min升溫至70℃，4℃/min升溫至160℃，10℃/min升溫至250℃保持5 min。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍28～500 amu，掃描方式為全掃描。

揮發(fā)性成分的定性及定量分析：未知揮發(fā)性化合物經(jīng)計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜圖庫美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）MS Search 2.0進行比對，結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）進行定性分析，以4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)物進行定量分析。

1.3.5 特香型大曲群落結(jié)構(gòu)分析

將大曲樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進行高通量測序。根據(jù)測序結(jié)果，對其物種注釋和豐度及α-多樣性等進行分析。將加工整理后的序列與silva庫（http：//www.arb-silva.de/）進行比對，進而對其群落結(jié)構(gòu)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 特香型大曲理化指標(biāo)測定結(jié)果

表1 特香型大曲理化指標(biāo)分析結(jié)果Table 1 Results of physicochemical indexes analysis for Te-flavour Daqu

由表1可知，大曲A中水分含量高于大曲B，可能是大曲A生產(chǎn)環(huán)境濕度高于大曲B導(dǎo)致；酸度和還原糖含量則大曲B高于大曲A，淀粉含量大曲A要略高，說明大曲B中產(chǎn)酸菌較多、淀粉被降解的更多。

除糖化酶活力大曲B略高外，大曲A的液化酶活力、蛋白酶活力、酯化力及發(fā)酵力分別比大曲B高27.54%、15.89%和14.73%。大曲A的發(fā)酵力為大曲B的3.26倍。

2.2 特香型大曲中揮發(fā)性成分分析

表2 特香型大曲揮發(fā)性成分分析結(jié)果Table 2 Results of volatile compounds analysis in Te-Daqu

續(xù)表

注：n.d表示未檢出。

由表2可知，兩種大曲共檢測出揮發(fā)性成分49種，多為醇類、酯類和醛酮類物質(zhì)。大曲A檢測出36種揮發(fā)性成分，包括6種醇、10種酯、7種醛酮、7種吡嗪以及其他類6種；大曲B檢測出33種揮發(fā)性成分，包括1種酸、7種醇、11種酯、5種醛酮、1種吡嗪以及其他類8種。

大曲A和B中醇類化合物含量分別為46.97 μg/kg和124.92 μg/kg。大曲A中含量最高的醇類化合物為（-）-異長葉醇，含量為31.01 μg/kg。苯乙醇是大曲B中含量最高的醇類化合物，含量為94.88 μg/kg，具有花草香和果香，對曲香的形成具有較大的貢獻。

γ-壬內(nèi)酯、豆蔻酸甲酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、原膜散酯、棕櫚酸甲酯、棕櫚酸乙酯、亞油酸甲酯、（Z）-油酸甲酯在兩種大曲中都被檢測到，大曲A中酯類化合物含量為41.64 μg/kg，其中低氣味的棕櫚酸甲酯是大曲A中含量最高的酯類化合物，含量為14.98 μg/kg。酯類化合物在大曲B中含量為29.21 μg/kg，其中含量最高的酯類化合物為低氣味的原膜散酯，含量為10.86 μg/kg。

醛酮類化合物也是大曲揮發(fā)性成分中重要的組成部分，大曲A和B分別檢測到41.98 μg/kg和12.61 μg/kg，大曲A中含量最高的醛是具有強烈的檸檬香氣的（E）-檸檬醛，其含量為9.53 μg/kg；大曲B中含量最高的醛是壬醛，含量為7.29 μg/kg。

大曲A中主要揮發(fā)性成分吡嗪類化合物占總揮發(fā)性成分的82.12%，總含量達1 009.13 μg/kg，其中川芎嗪含量達844.27 μg/kg，占吡嗪類化合物83.66%。而在大曲B中吡嗪類只有川芎嗪，含量為12.31 μg/kg。

2.3 特香型大曲微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析2.3.1大曲微生物多樣性分析

采用高通量測序?qū)Υ笄形⑸镞M行測序，序列經(jīng)過優(yōu)化后，16S rRNA測序共得到有效序列77 492條，平均每條序列長度為401.63 bp；18S rRNA測序共得到有效序列74 478條，平均每條序列長度為445.97 bp。稀釋曲線可用來說明樣本取樣大小是否合理，兩種特香型大曲的稀釋性曲線見圖1。從圖1可以看出，曲線有趨于平緩的趨勢，說明樣品中所有的物種基本被覆蓋，測序深度足夠。

圖1 大曲中細(xì)菌（a）和真菌（b）稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacteria(a)and fungi(b)in Daqu

表3 大曲中細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)Table 3 Bacterial and fungal diversity indexes in Daqu

大曲中細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)見表3。由表3可知，細(xì)菌操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）數(shù)明顯高于真菌，可見大曲中細(xì)菌種類要比真菌復(fù)雜，同時大曲B中細(xì)菌種類組成比大曲A復(fù)雜，而真菌則呈現(xiàn)相反的趨勢。細(xì)菌多樣性大曲B高于大曲A，而真菌多樣性則大曲A更高。Chao1指數(shù)無論是細(xì)菌還是真菌，大曲B均高于大曲A，說明大曲B微生物群落豐富度均比大曲A高。這些差異可能是由于制曲環(huán)境所產(chǎn)生的，生產(chǎn)大曲A的曲房所處贛江邊人煙稀少、空氣潮濕，環(huán)境空氣中細(xì)菌種類復(fù)雜程度遠(yuǎn)低于人煙稠密的市區(qū)生產(chǎn)大曲B的曲房，但是潮濕江邊環(huán)境中真菌種類多于市區(qū)。測序覆蓋率（Coverage）指數(shù)均＞0.99，說明測序數(shù)目足夠，所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3.2 大曲微生物群落結(jié)構(gòu)分析

圖2（A）和圖2（B）顯示了大曲樣品中細(xì)菌和真菌在屬水平上的相對豐度。細(xì)菌高通量測序結(jié)果顯示，兩種大曲共檢測到271個不同屬細(xì)菌，相對豐度＞1%的有19個屬，兩種大曲中細(xì)菌組成差異顯著，大曲A中主要為克羅彭斯特菌（Kroppenstedtia）和海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus），分別占細(xì)菌總量的44.46%和37.08%。以產(chǎn)液化酶和蛋白酶強的芽孢桿菌（Bacillus）也為大曲A中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，相對豐度為7.70%，而大曲B中僅為1.78%，這與表1中大曲A表現(xiàn)出更高的蛋白酶和液化酶活力結(jié)果一致。芽孢桿菌還具有調(diào)節(jié)白酒風(fēng)味的作用，是白酒釀造過程中一類重要的功能微生物[16]。此外，吡嗪類物質(zhì)多由芽孢桿菌產(chǎn)生[17]，大曲A中吡嗪類化合物含量遠(yuǎn)高于大曲B，進一步說明大曲A中芽孢桿菌含量較高。而大曲B中豐度高達17.47%的產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes），不能利用糖類，沒有產(chǎn)淀粉酶和糖化酶能力。醋酸菌屬（Acetobacter）和乳桿菌屬（Lactobacillus）是大曲中兩大重要的細(xì)菌屬，在大曲發(fā)酵過程中，分別可產(chǎn)生乙酸和乳酸，經(jīng)過酶的作用和乙醇反應(yīng)生成乙酸乙酯和乳酸乙酯，對白酒的風(fēng)味具有重要貢獻，乳酸菌在A、B大曲中相對豐度分別為2.71%和1.77%，醋酸菌在大曲A中占比為1.70%，未在大曲B中檢測出。大曲B中含量較高的魏斯氏菌屬（Weissella）具有將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇或乙酸的作用，其相對豐度為7.05%，而在大曲A中未檢測到，因此大曲B中醇類化合物和酸類化合物含量高于大曲A。在大曲B中還檢測到豐度為9.54%的高溫放線菌（Thermoactinomyces），代謝可產(chǎn)生α-耐高溫淀粉酶、纖維素酶及幾丁質(zhì)酶等多種耐高溫酶系[18]，但其產(chǎn)生的土霉異味常在白酒中能檢測到[19]。

圖2 大曲中細(xì)菌（A）和真菌（B）在屬水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria(A)and fungi(B)at genus level in Daqu

屬水平上分析，兩種大曲共檢測到60個真菌屬，相對豐度＞1%的主要有17個屬。比較發(fā)現(xiàn)，兩者真菌群落組成相差不大，但比例差異明顯。大曲A中各菌屬相對豐度較均衡，占比靠前的包括norank-d-Eukaryote和真菌屬（norankk-Fungi），分別占真菌總量的24.68%和19.12%。大曲B中豐度最高的為嗜熱子囊菌屬（Thermoascus），相對豐度達53.18%，大曲發(fā)酵過程中，嗜熱子囊菌屬能產(chǎn)生熱穩(wěn)定的水解酶，如纖維素酶和木聚糖酶，繼而將谷物中的纖維素降解，是大曲發(fā)酵不可或缺的重要菌屬。曲霉屬（Aspergillus）是大曲中普遍存在的，也是兩種大曲中優(yōu)勢真菌屬之一，大曲A中相對豐度為6.39%，相比于大曲B中12.98%較低，能產(chǎn)生多種蛋白酶及其他分解酶類，將蛋白質(zhì)和淀粉類物質(zhì)水解為多肽、糖類、氨基酸等降解產(chǎn)物，對大曲糖化力、液化力和生香作用都有很大的影響。

畢赤酵母屬（Pichia）具有較強產(chǎn)酯功能，能夠生成大量酯類風(fēng)味物質(zhì)，是白酒釀造中一類重要的功能微生物。大曲B中檢測到畢赤酵母屬相對豐度為2.07%，遠(yuǎn)高于大曲A（0.31%）。大曲A中除畢赤酵母外還檢測到其他酵母屬2.60%，而大曲B中只檢測到1.12%。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、產(chǎn)酯酵母、假絲酵母（Candida）和畢赤酵母（Pichia pastoris）為酵母屬中主要的種屬，其中釀酒酵母具有較強的產(chǎn)酒精能力，產(chǎn)酯酵母可利用酸類和醇類物質(zhì)生成酯類物質(zhì)[20]，這可能是大曲A發(fā)酵力高于大曲B及大曲A中酯類含量高于大曲B的原因。

3 結(jié)論

本研究首次利用高通量測序技術(shù)對特香型大曲中微生物進行分析，并將大曲理化指標(biāo)、揮發(fā)性成分和微生物群落3者結(jié)合起來，更好地闡述制曲環(huán)境影響特香型白酒大曲中優(yōu)勢菌種的種類及豐度，這些優(yōu)勢絲狀真菌和細(xì)菌在大曲發(fā)酵過程中代謝生產(chǎn)大量淀粉酶、糖化酶和蛋白酶，另外釀酒酵母和產(chǎn)酯酵母則提供發(fā)酵力和酯化力，是導(dǎo)致贛江邊曲房生產(chǎn)的大曲各項關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)優(yōu)于市區(qū)曲房產(chǎn)大曲的重要原因之一，可以作為特香型大曲標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和提高特香型白酒品質(zhì)的理論依據(jù)。