常溫常壓等離子體誘變選育高產(chǎn)L-異亮氨酸谷氨酸棒桿菌

孔 帥，陳 敏，鄭美娟，許鵬飛，呂育財，謝 飛，周宜平，龔大春*

（1.三峽大學 湖北省生物酵素工程技術研究中心，湖北 宜昌 443002；

2.宜昌三峽制藥有限公司，湖北 宜昌 443002）

L-異亮氨酸是人體8種必需氨基酸之一，同時又是3種支鏈氨基酸之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在生命代謝中具有重要作用[1]，已被廣泛應用于食品、動物飼料和醫(yī)藥等行業(yè)[2]。L-異亮氨酸的生產(chǎn)方法主要有水解法、化學合成法和生物發(fā)酵法。生物發(fā)酵法因其原料成本低、易于控制、節(jié)能環(huán)保成為工業(yè)化生產(chǎn)的首選方法。但是，目前國內(nèi)L-異亮氨酸的生產(chǎn)效率不高，與國外有較大差距，其中高產(chǎn)菌株的缺乏已成為發(fā)酵法制備L-異亮氨酸的技術瓶頸之一[3-6]。

常溫常壓等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種技術是一種微生物基因組快速突變技術[7-9]。該技術具有成本低、操作簡便、安全性、等離子體產(chǎn)生條件溫和、富含大量活性粒子、突變譜廣、突變率高等優(yōu)點，被廣泛用于細菌、真菌、微藻等微生物的生物育種[10-14]。高產(chǎn)L-異亮氨酸菌株的篩選方法是當前ARTP誘變育種的研究重點。在L-異亮氨酸的合成途徑中，天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶存在著反饋抑制作用，若解除該反饋抑制能使代謝流更加通暢，從而增加L-異亮氨酸的產(chǎn)量[15-20]?；前冯沂翘於彼岬慕Y(jié)構(gòu)類似物，如果將磺胺胍加入培養(yǎng)基中用于菌株的篩選，期望得到磺胺胍抗性突變株，有效解除天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制，使天冬氨酸大量合成，從而提高L-異亮氨酸產(chǎn)量。在得到突變庫的基礎上，利用茚三酮與氨基酸的顯色反應可以結(jié)合多功能酶標儀實現(xiàn)多孔板的高通量篩選。

因此，本實驗采用ARTP誘變儀對谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）23798進行誘變，然后采用適宜濃度的磺胺胍抗性標記進行初篩，再利用氨基酸與茚三酮顯色反應機理進行高通量篩選，最后通過發(fā)酵培養(yǎng)進行復篩，以期得到高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變谷氨酸棒桿菌，并對其遺傳穩(wěn)定性進行研究，為后續(xù)的發(fā)酵放大培養(yǎng)優(yōu)化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum）23798：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China center of industrial culture collection，CICC）。

1.1.2 試劑

氯化鈉、硫酸銨、磷酸氫二鈉苯（均為分析純）：天津科密歐化學試劑有限公司；L-異亮氨酸、茚三酮、乙醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉、牛肉浸粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，氯化鈉5g/L，牛肉浸粉3g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氫二鈉1 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨7 g/L，氯化鈉5 g/L，牛肉浸粉3 g/L，磷酸氫二鈉1 g/L，酵母浸粉5 g/L，硫酸銨6 g/L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基葡萄糖單獨滅菌，滅菌條件均為1×105Pa滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

ARTP-M常溫常壓等離子體誘變育種儀：無錫源清天木生物科技有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；ZQRY-180S恒溫搖床：上海知楚儀器有限公司；SP-Max 2300A光吸收型全波長酶標儀：上海閃譜生物科技有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；Leopard70-2A微孔板恒溫振蕩器：萊普特科學儀器（北京）有限公司；MX-307落地高速冷凍離心機：日本TOMY公司；UV-1800分光光度計：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；XW-80A旋渦混合儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8900氨基酸分析儀：日本天美科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及培養(yǎng)

將保存的谷氨酸棒桿菌23798劃線接種于活化培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)3 d；將平板上的菌種刮取一環(huán)接種到100 mL種子培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h，將種子液制成OD600nm值為0.7的菌懸液，加入5%甘油，備用。

1.3.2 菌株的ARTP誘變時間的考察[21]

將ARTP的溫度保持在20℃，調(diào)節(jié)功率為120 W，氦氣（He）流量為10 L/min。吸取10 μL菌懸液于無菌金屬載片上，將載片放入誘變室內(nèi)，發(fā)射源距離菌液2 mm，采用不同的時間（0 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s）對菌液進行誘變處理。將誘變的菌體接入1 mL生理鹽水中振搖1min，取100μL涂布到活化培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2d，計算致死率，確定最佳誘變時間，其計算公式如下：

1.3.3 誘變篩選抗性標記磺胺胍濃度的考察

將無菌磺胺胍加入50mL活化培養(yǎng)基中，使磺胺胍最終質(zhì)量濃度分別為0、0.10 mg/mL、0.15 mg/mL、0.20 mg/mL、0.25mg/mL、0.30mg/mL、0.35mg/mL、0.40mg/mL。將100μL種子菌懸液涂布于含磺胺胍的抗性平板上，37℃培養(yǎng)2 d，觀察菌體生長情況，確定誘變菌株抗性標記所采用的最佳磺胺胍質(zhì)量濃度。

1.3.4 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的篩選

以谷氨酸棒桿菌23798為出發(fā)菌株，在最佳誘變時間條件下進行ARTP誘變，涂布到含有最佳磺胺胍質(zhì)量濃度的抗性標記平板上，37℃培養(yǎng)2 d。挑選生長快速、單菌落較大的菌株，用竹簽將平板上誘變的菌株接種到含1 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中培養(yǎng)48 h后，離心，取上清液20 μL至96圓孔深孔板中，每個孔板加入240 μL 0.5%的茚三酮溶液，70℃水浴8 min，然后冷卻至室溫，用酶標儀測定波長570 nm處的吸光度值（OD570nm值），挑選出OD570nm值較大的菌株，采用薄層層析-分光光度法[22]和氨基酸分析儀[23-24]進行定性定量。通過搖瓶復篩，取上清液，利用氨基酸分析儀檢測其L-異亮氨酸含量[24]，獲得高產(chǎn)L-異亮氨酸的谷氨酸棒桿菌誘變菌株。

1.3.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株發(fā)酵培養(yǎng)

將原始菌株和篩選得到的高產(chǎn)L-異亮氨酸的誘變菌株分別接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)16 h；按10%（V/V）的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，利用氨基酸分析儀測定其L-異亮氨酸含量。

1.3.6 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將誘變菌株在活化培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次，再進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用氨基酸分析儀檢測菌株的L-異亮氨酸產(chǎn)量，研究其遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳誘變時間的確定

等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起基因損傷，進而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡發(fā)生顯著變化，最終導致微生物產(chǎn)生突變。誘變時間和作用強度對微生物致死率的影響較大，致死率過低或過高都不利于篩選。因此，在不同誘變時間下，考察誘變時間對谷氨酸棒桿菌致死率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 谷氨酸棒桿菌ARTP誘變致死率曲線Fig.1 Curve of lethallty rate forCorynebacterium glutamicumbyARTP mutagenesis

從圖1可以看出，ARTP對Corynebacterium glutamicum的殺傷力較大，當誘變時間為60～120 s時，該菌株致死率呈直線增長，且當誘變時間為120s時，菌株致死率達到88%左右；當誘變時間為180 s時，菌株致死率達到98.44%；當誘變時間為240 s時，菌株致死率接近100%。為了保證一定的突變率，選擇相應的誘變時間至關重要。因此，選擇致死率達到98.44%的180 s為最佳誘變時間。

2.2 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的抗性篩選

磺胺胍為天冬氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，通過選育磺胺胍抗性突變株能遺傳性地解決天冬氨酸對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的反饋抑制[19]。研究發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度的磺胺胍對細胞的抑制程度不同，因此，需要優(yōu)化磺胺胍質(zhì)量濃度，使篩選效果達到最佳。不同磺胺胍質(zhì)量濃度對Coryne bacterium glutamicum的抑制率如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量濃度磺胺胍對谷氨酸棒桿菌生長的影響Fig.2 Effect of different sulfaguanidine contents on the growth of Corynebacterium glutamicum

從圖2可以看出，磺胺胍對Corynebacteriumglutamicum的抑制效果明顯。當磺胺胍質(zhì)量濃度＜0.1mg/mL之前，抑制作用較小；當磺胺胍質(zhì)量濃度達到0.3mg/mL時，抑制效果增強，抑制率達到97%左右；當磺胺胍質(zhì)量濃度達到0.4mg/mL時，菌體不能生長，故選取質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的磺胺胍進行抗性標記篩選。

采用ARTP誘變儀對谷氨酸棒桿菌菌懸液誘變180 s，將誘變的菌體涂布于含有0.4 mg/mL磺胺胍的活化培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2 d，從中篩選獲得菌落生長快、菌落大的42個單菌落，編號為A1～A6、B1～B6、C1～C6、D1～D6、E1～E6、F1～F6、G1～G6。

2.3 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的高通量篩選

挑選菌落較大的42個單菌落于24孔板培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48 h，以原始菌株吸光強度為1.0，測定樣品的相對吸光度值，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同誘變菌株的相對吸光強度Fig.3 Relative absorbance intensity of different mutants

由圖3可知，大多數(shù)誘變菌株的相對吸光度值高于原始菌株，且其中3株誘變菌株B1、D6、E5的相對吸光度值高于原始菌株的20%以上，通過薄層層析-分光光度法和氨基酸分析儀對這3株誘變菌株的發(fā)酵上清液中的L-異亮氨酸進行定性、定量，進一步確認3株誘變菌株L-異亮酸產(chǎn)量高于原始菌株。因此，對誘變菌株B1、D6、E5進行搖瓶復篩驗證實驗。

2.4 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的發(fā)酵培養(yǎng)復篩

將誘變菌株B1、D6、E5和原始菌株進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，利用氨基酸分析儀檢測發(fā)酵48 h時的L-異亮氨酸產(chǎn)量，結(jié)果如表1所示。

表1 誘變菌株的L-異亮氨酸Table 1 L-isoleucine production of mutants

由表1可以看出，與原始菌株相比，誘變菌株B1、D6、E5具有較好的L-異亮氨酸生產(chǎn)性能，其產(chǎn)量分別增加62.03%、30.89%、14.19%，其中誘變菌株B1的L-異亮氨酸生產(chǎn)能力最高。由此可見，本實驗的篩選方法是行之有效的。

2.5 高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性

為了檢驗誘變菌株B1能否保持穩(wěn)定的遺傳特性，將誘變菌株B1連續(xù)傳代培養(yǎng)10次，并同時進行發(fā)酵培養(yǎng)，采用氨基酸分析儀對發(fā)酵上清液中L-異亮氨酸的產(chǎn)量進行測定，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，從第1代到第10代，誘變菌株B1的L-異亮氨酸產(chǎn)量基本保持穩(wěn)定，可見該誘變菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

圖4 誘變菌株B1的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strain B1

3 結(jié)論

從原始菌株Corynebacterium glutamicum23798出發(fā)，經(jīng)過ARTP誘變處理180 s后，涂布于含0.4 mg/mL磺胺胍培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2 d，挑選出菌落較大的菌株，接種至24孔板液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用氨基酸與茚三酮的特異性反應與相對應的菌株發(fā)酵上清液進行96孔酶標儀高通量篩選，選育出一株高產(chǎn)L-異亮氨酸誘變Corynebacterium glutamicumB1。該菌株搖瓶發(fā)酵48 h后，L-異亮氨酸產(chǎn)量達18.5 g/L，較原始菌株提高62.03%，且遺傳性狀穩(wěn)定。該研究通過將ARTP隨機誘變與磺胺胍定向抑制微生物產(chǎn)酸代謝途徑中的關鍵酶相結(jié)合，增大誘變菌株向L-異亮氨酸積累方向突變的幾率，提高優(yōu)良菌株的篩選效率，為產(chǎn)L-異亮氨酸菌株的選育提供了高效的篩選方法，為其他高產(chǎn)氨基酸菌株的篩選提供重要參考。