利用一株凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵酸解玉米秸稈生產(chǎn)乳酸

倪志華，張玉明*

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

乳酸是一種重要的有機酸，以乳酸為單體合成的聚乳酸生物塑料被認為是石化塑料的最佳替代品之一，利用可再生生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸可實現(xiàn)資源綠色循環(huán)應(yīng)用[1]。我國是農(nóng)業(yè)大國，玉米秸稈資源豐富，利用玉米秸稈生物煉制乳酸，不但可以降低原料成本、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物綠色利用，而且可以解決秸稈丟棄、焚燒造成的環(huán)境污染問題[2-3]。

微生物是生物煉制的主要參與者，根霉菌和乳酸細菌是研究最多的乳酸生產(chǎn)菌。劉占英等[4]對一株可直接降解纖維素生產(chǎn)乳酸的糞腸球菌（Enterococcus faecalis）進行紫外誘變育種，該菌株可利用玉米秸稈獲得0.63 g/L乳酸。李鑫等[5]以米根霉（Rhizopus oryzae）為菌種，生物轉(zhuǎn)化經(jīng)汽爆和堿處理后玉米秸稈酶解液（含有葡萄糖100 g/L），最終獲得69.15 g/L乳酸。對乳酸生物煉制過程優(yōu)化可降低生產(chǎn)成本，提高乳酸生產(chǎn)效率。王剛等[6]使用左旋乳酸芽孢桿菌W-1開展了玉米秸稈同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharificationandfermentation，SSF）產(chǎn)乳酸研究，在90g/L葡萄糖基質(zhì)中添加高溫蒸煮的玉米秸稈和纖維素酶300U/L，經(jīng)過6 d發(fā)酵可獲得72 g/L乳酸。陳曉佩等[7]對米曲霉進行細胞固定化處理，將濃縮的玉米秸稈酸爆液（含有葡萄糖60 g/L）轉(zhuǎn)化為乳酸36.4 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率63.5%。

目前，利用秸稈生物煉制乳酸存在菌種適應(yīng)性差、原料利用率低、糖酸轉(zhuǎn)化率低等技術(shù)難題，尚未實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[8]。針對上述問題，本研究以一株凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為菌種，開展玉米秸稈生物煉制乳酸研究。借助該菌株高溫發(fā)酵、己糖/戊糖高效利用等特點，以期建立一種利用酸解玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乳酸新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈：采集于河北省保定市東金莊村農(nóng)田；纖維素酶（25FPU/mL）：寧夏夏盛集團；β-葡萄糖苷酶（593CBU/mL）：丹麥諾維信公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖（純度均為99%），L-乳酸鈉（純度98%）：阿拉丁公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）CGMCC No.7635（以下簡稱菌株BCO）：本實驗室保存。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，酵母粉20 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.05 g/L，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BLBIO-7GC發(fā)酵罐：上海佰倫公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司；MLS-3750全自動滅菌鍋：日本三洋公司；SBA-40D生物傳感分析儀：山東省科學(xué)院生物研究所。1.3方法

1.3.1 菌株BCO混合糖發(fā)酵實驗

由于玉米秸稈等木質(zhì)纖維素水解液中可發(fā)酵糖類主要為葡萄糖、木糖和阿拉伯糖[2]，本實驗首先考察菌株BCO利用混合糖發(fā)酵乳酸能力。分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加總質(zhì)量濃度為60 g/L的混合糖，其中A組為20 g/L葡萄糖+33 g/L木糖+7g/L阿拉伯糖，B組為30g/L葡萄糖+25g/L木糖+5g/L阿拉伯糖。乳酸發(fā)酵實驗在發(fā)酵罐中進行，培養(yǎng)條件為50℃、100 r/min、pH 6.0。

1.3.2 玉米秸稈預(yù)處理和酶解實驗

玉米秸稈洗凈、烘干、粉碎，過80目篩，以1∶8（mg∶L）的固液比置于2%硫酸溶液中，混勻后121℃濕熱處理90 min，5 000 r/min離心15 min獲得的上清液定義為酸水解液；離心獲得的沉淀使用水洗滌至中性，烘干至質(zhì)量恒定，定義為水不溶物（water insoluble solid，WIS）。將WIS用50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖溶液（pH4.8）溶解，添加纖維素酶后在50℃、200r/min條件下進行酶解實驗。為了避免酶解產(chǎn)物纖維二糖的抑制作用，酶解時加入20CBU/g纖維素的β-葡萄糖苷酶。

1.3.3 糖化發(fā)酵

將斜面培養(yǎng)的菌株BCO接種到含有20 g/L葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中，45℃、100 r/min培養(yǎng)6 h，制備BCO種子培養(yǎng)液。將干質(zhì)量為100g的玉米秸稈使用1.3.2方法進行預(yù)處理，將預(yù)處理后的料液pH值調(diào)整為5.0后加入終濃度2%的酵母粉和BCO種子培養(yǎng)液進行發(fā)酵實驗（接種量為5%）。當料液中葡萄糖質(zhì)量濃度＜1.0g/L時，加入纖維素酶開啟SSF生產(chǎn)乳酸實驗。當發(fā)酵體系中乳酸濃度不再增加時，加入WIS粉末40 g和纖維素酶進行補料實驗以提高產(chǎn)物乳酸濃度。SSF在發(fā)酵罐中進行，培養(yǎng)條件為50℃、100 r/min、pH5.0。上述方法中纖維素酶添加量均為20 FPU/g纖維素。

1.3.4 測定方法

發(fā)酵液中糖和產(chǎn)物濃度：使用高效液相色譜儀測定[9]；玉米秸稈中纖維素含量：采用美國國家可再生能源實驗室（nationnal renewable energy laboratory，NREL）推薦的方法測定[10]；L-乳酸含量：由生物傳感分析儀測定；發(fā)酵產(chǎn)物中L-乳酸的光學(xué)純度計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BCO對混合糖的利用

圖1 不同碳源比例對菌株BCO發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的影響Fig.1 Effect of different carbon source ratio on lactic acid productionby strain BCO

由圖1可知，當使用A組碳源時，菌株BCO對葡萄糖和木糖的利用幾乎是同步的，發(fā)酵開始16 h后，碳源耗盡；使用B組碳源時，菌株BCO首先利用葡萄糖，再利用木糖和阿拉伯糖，發(fā)酵過程持續(xù)到20 h時碳源耗盡。這種優(yōu)先利用葡萄糖，再依次利用其他碳源的現(xiàn)象，稱為碳源代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）效應(yīng)[11]。CCR效應(yīng)會嚴重降低混合糖利用速度，導(dǎo)致發(fā)酵時間延長。因此，針對解除CCR效應(yīng)的研究工作有很多報道，涉及菌種遺傳改造[12]和發(fā)酵策略設(shè)計[13]。本研究顯示，菌株BCO在利用混合糖時存在CCR效應(yīng)，并且糖濃度比例變化也會影響菌株的糖利用模式。使用A組碳源和B組碳源所獲得產(chǎn)物乳酸的終質(zhì)量濃度分別為（50.54±1.42）g/L和（51.04±1.23）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率分別為（0.92±0.02）g/g和（0.93±0.02）g/g。該結(jié)果說明，BCO能夠同型發(fā)酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產(chǎn)乳酸，且具備高溫發(fā)酵特點，非常適合SSF工藝。

2.2 利用玉米秸稈酸水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

通常木質(zhì)纖維素經(jīng)預(yù)處理后產(chǎn)生糠醛、乙酸等副產(chǎn)物會對微生物生長產(chǎn)生強烈的抑制作用，甚至?xí)绊懫鋵Φ孜锏霓D(zhuǎn)化效率[14]。

玉米秸稈經(jīng)預(yù)處理，所得玉米秸稈稀酸水解液中含有混合糖（葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L）和一定量的發(fā)酵抑制物（乙酸（2.01±0.12）g/L，甲酸（0.04±0.01）g/L，糠醛（0.02±0.01）g/L，5-羥甲基糠醛（0.03±0.02）g/L）。由圖2可知，由于料液中存在一定量的抑制物，接種開始8h后菌株BCO才開始利用其中的糖基質(zhì)生產(chǎn)乳酸，發(fā)酵24h后獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為（0.93±0.02）g/g。表明菌株BCO對玉米秸稈酸水解液中混合糖實現(xiàn)了同型乳酸發(fā)酵，且預(yù)處理產(chǎn)生的副產(chǎn)物未對發(fā)酵過程產(chǎn)生明顯影響。

圖2 菌株BCO發(fā)酵玉米秸稈酸水解液生產(chǎn)乳酸Fig.2 Production of lactic acid from corn stalk acid hydrolysate by strain BCO

2.3 玉米秸稈WIS的纖維素酶解

使用100g玉米秸稈酸解后獲得WIS的干質(zhì)量為（58.72±2.16）g，以其為底物考察纖維素酶添加量對酶解效率的影響（固液填充比率為5.87%），酶解結(jié)果見表1。

表1 纖維素酶添加量對酶解效率的影響Table 1 Effect of cellulase addition on enzymatic hydrolysis efficiency

由表1可知，隨著纖維素酶添加量的增加，酶解時間不斷縮短，并且酶解產(chǎn)物葡萄糖的質(zhì)量濃度也逐漸升高。纖維素酶添加量達到20 FPU/g時，酶解時間縮短至30 h，酶解產(chǎn)物葡萄糖的質(zhì)量濃度增至22.26 g/L；繼續(xù)增加纖維素酶添加量，酶解時間及酶解產(chǎn)物變化不大。因此綜合酶解效率和纖維素酶成本考慮，20 FPU/g纖維素酶+20 CBU/g β-葡萄糖苷酶是玉米秸稈WIS的最佳酶用量，此時玉米秸稈WIS的酶解效率為（63.54±2.03）%。該結(jié)果也說明2%硫酸預(yù)處理方法可以使玉米秸稈中纖維素充分暴露，被纖維素酶水解。

2.4 菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

菌株BCO具備纖維二糖的利用能力[9]，因此SSF過程無需額外添加β-葡萄糖苷酶，菌株BCO利用酸水解玉米秸稈SSF發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程曲線見圖3。

圖3 菌株BCO利用玉米秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程曲線Fig.3 Curve of lactic acid production from corn stalk by strain BCO with solid-state fermentation

由圖3可知，由于酶解作用，發(fā)酵體系中葡萄糖和纖維二糖濃度迅速增高。但是隨著菌株BCO的生長，葡萄糖和纖維二糖逐漸被轉(zhuǎn)化為乳酸，酶解產(chǎn)物抑制被有效緩解。葡萄糖和纖維二糖是纖維素酶解的兩個最重要抑制物，菌株BCO可將上述兩種碳源發(fā)酵生成乳酸，不僅提高了SSF效率，并且可降低纖維素酶使用量[15-16]。在發(fā)酵開始65 h后，料液中基質(zhì)幾乎消耗完全，乳酸含量為（38.38±1.03）g/L。此時100 g玉米秸稈生物轉(zhuǎn)化得到乳酸（40.19±1.22）g，L-乳酸光學(xué)純度為（99.23±0.22）%。與其他中溫菌SSF發(fā)酵過程相比，BCO生長溫度與商品纖維素酶最佳活力溫度相一致，纖維素酶的活性得到全部發(fā)揮，因此發(fā)酵過程更為高效[8]。乳酸生物煉制時，受限于原料預(yù)處理填充率問題，不能獲得高濃度的糖，因此產(chǎn)物乳酸濃度偏低[17]。針對此問題，有研究使用汽爆[18]等高效的原料預(yù)處理方法或者改進纖維素酶解工藝，可獲得到高濃度的可發(fā)酵糖類[19]。當然，進行SSF發(fā)酵時采用補料工藝也可獲得濃度產(chǎn)物[20-21]。本研究在SSF發(fā)酵進行至65 h時和100 h時，分別補加了玉米秸稈WIS干粉40g和纖維素酶（補加量為20FPU/g纖維素）。由于補加了底物和酶，BCO進行了“二次發(fā)酵”，玉米秸稈WIS酶解產(chǎn)物（葡萄糖和纖維二糖）被持續(xù)利用。發(fā)酵至135h后，產(chǎn)物乳酸含量達到（82.56±1.28）g/L。借助菌株BCO和工藝優(yōu)化，本研究建立的玉米秸稈生物煉制乳酸方法，可將原料酸解/酶解獲得的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖高效轉(zhuǎn)化生成乳酸，省去了料液脫毒和WIS與玉米秸稈酸解液分別發(fā)酵的多步工藝單元。

3 結(jié)論

凝結(jié)芽孢桿菌BCO具有高溫生長，同型發(fā)酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖生產(chǎn)乳酸能力，是一株良好的乳酸生物煉制菌。本研究使用的2%硫酸預(yù)處理工藝可酸解100 g玉米秸稈生成葡萄糖（6.95±0.98）g/L、木糖（23.39±1.23）g/L、阿拉伯糖（5.35±0.87）g/L。以其為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源，菌株BCO可發(fā)酵獲得乳酸（30.93±0.62）g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率（0.93±0.02）g/g。進一步開展玉米秸稈SSF研究，原料經(jīng)酸水解后無需固液分離，調(diào)整pH值后以20 g/L酵母粉為氮源，添加纖維素酶20 FPU/g纖維素后發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，65 h后可獲得乳酸（38.38±1.03）g/L，其中L-乳酸光學(xué)純度為（99.23±0.22）%。為了提高產(chǎn)物濃度，向發(fā)酵體系補加玉米秸稈WIS和纖維素酶，最終獲得乳酸（82.56±1.28）g/L。