滑子菇多糖的結(jié)構(gòu)及體外生物活性探究

陳楊揚(yáng) 李 嬌 王向紅 李 琪 劉曉宇 桑亞新

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001）

滑子菇（Pholiota nameko），又名珍珠菇、真姬菇、滑菇，是一種藥食兼用真菌，屬真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、絲膜菌科、鱗傘屬[1]。 1976年我國北方由日本引進(jìn)滑子菇，主要產(chǎn)區(qū)為河北北部、黑龍江等低溫地帶。 研究表明， 滑子菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化[2]、抗輻射、防衰老、降脂保肝[3]等重要的生理活性。

多糖是自然界中一種含量較為豐富的高分子聚合物， 由10 個以上單糖通過糖苷鍵連接而成，其性質(zhì)遠(yuǎn)不同于單糖。 多糖結(jié)構(gòu)是多糖呈現(xiàn)不同生物活性的基礎(chǔ)， 認(rèn)識多糖的結(jié)構(gòu)有助于更好地開發(fā)利用多糖。 多糖構(gòu)效關(guān)系研究表明，多糖的單糖組成、糖苷鍵類型、取代基類型、分子大小等均對其生物活性有一定影響。 大多數(shù)具有突出生物活性的多糖都以（1→3）糖苷鍵[4-5]連接，與此同時帶有一些側(cè)鏈， 糖基上還連接有一些特殊的功能團(tuán)。 如香菇多糖[5]主鏈以β-（l→3）鍵連接，側(cè)鏈與主鏈間以β-（l→6）鍵連接，具有抗腫瘤作用及提高細(xì)胞免疫及體液免疫功能。冬蟲夏草多糖[6]的單糖組成為甘露糖、半乳、葡萄糖，具有提高機(jī)體免疫，抑制腫瘤細(xì)胞的作用，并能改善化療引起的不良反應(yīng)。

機(jī)體的免疫活性細(xì)胞包括脾臟中T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞， 其增殖情況是反映細(xì)胞免疫機(jī)制最直接的指標(biāo)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖[8]能有效促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的增殖， 并能夠協(xié)同ConA 和LPS促進(jìn)T、B 淋巴細(xì)胞的增殖作用。 苜蓿多糖和黃芪多糖[9]在一定濃度下能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，表明苜蓿多糖和黃芪多糖發(fā)揮免疫作用與促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。

基于多糖類物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系鮮見研究報道。本研究探究PNP 的結(jié)構(gòu)及免疫活性， 明確多糖中糖鏈的結(jié)構(gòu)信息對于了解糖類物質(zhì)在生物體內(nèi)的活動行為和本質(zhì)具有重要意義， 同時為活性多糖的構(gòu)效研究及人工修飾提高生物活性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滑子菇， 采摘于承德森源綠色食品有限公司平泉縣養(yǎng)殖基地；剛果紅，天津市華東試劑廠；碘，上海醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；碘化鉀，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；無菌小白鼠20日齡，由河北醫(yī)科大學(xué)提供；RPMI-1640 培養(yǎng)基，Thermo 公司；無原體新生牛血清， 浙江天杭生物科技股份有限公司；刀豆蛋白（ConA）、四甲基偶氮唑（MTT），北京索萊寶科技有限公司； 其他均為分析級試劑購買于天津天力公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器， 昆山市超聲儀器有限公司；TGL 16M 臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南易達(dá)京華有限公司；IKA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀， 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；FD5-2.5 冷凍干燥機(jī)，SIM 科技有限公司；K5600 超微量分光光度計，北京凱奧科技發(fā)展有限公司；Spectrum 65 傅里葉紅外光譜儀，美國PerkinElmer 公司；Ultrashield 400核磁共振波譜儀，BRUKER 公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺， 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MCO-18AC CO2培養(yǎng)箱，日本SANYO 三洋有限公司；YS100 顯微鏡，Nikon 儀器公司；1500-823 型酶標(biāo)儀，Thermo Scientific 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 滑子菇多糖的提取 滑子菇洗滌干凈，110℃烘干至恒重、粉碎成末，以1∶20 料液比溶于水，400 W 功率超聲20 min，80 ℃熱水浸提6 h 后離心取上清，Sevage 法除去蛋白（3～4 次），離心分離所得多糖溶液層進(jìn)行旋蒸濃縮，3 倍體積95%乙醇進(jìn)行醇沉過夜，離心、透析、凍干、經(jīng)DEAESepharose Fast Flow 和Sephadex G100 純化得到酸性滑子菇多糖PNP， 高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測其分子質(zhì)量為16 202.91 u，柱前衍生HPLC 法測其單糖組成為Man∶Glu∶Gal∶Xyl=6.90% ∶22.81% ∶56.28%∶14.01%[10]。

1.3.2 滑子菇多糖的結(jié)構(gòu)分析[11-12]

1.3.2.1 紅外光譜分析 稱取2.0 mg PNP 樣品進(jìn)行KBr 壓片， 在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描，分辨率為4 cm-1。

1.3.2.2 核磁共振圖譜分析1H NMR 譜： 稱取純化干燥后的PNP 樣品（20 mg）， 溶解在0.5 mL重水（D2O）中，用注射器置于5 mm 核磁管中，Ultrashield 400 核磁共振儀上分析測定氫譜。

1.3.2.3 β-消除反應(yīng) 取PNP 樣品5 mg， 加蒸餾水5 mL，并加0.4 mol/L NaOH 溶液2.5 mL，于45 ℃水浴鍋中水浴反應(yīng)3 h，然后紫外光譜掃描。

1.3.2.4 剛果紅試驗(yàn) 稱取5 mg 的PNP 樣品，加2.5 mL 蒸餾水溶解，并加入80 μmol/L 的剛果紅試劑2.5 mL， 逐漸加入濃度為1 mol/L 的NaOH，使NaOH 在溶液中的終濃度從0 mol/L 逐漸升到0.5 mol/L， 進(jìn)行紫外可見光譜掃描， 測得不同NaOH濃度下的最大吸收波長。

1.3.2.5 碘-碘化鉀反應(yīng) 稱取2 mg PNP 樣品，加蒸餾水2 mL，加入1.2 mL 的碘試劑（含0.02%I2的0.2% KI 溶液）， 混勻后進(jìn)行紫外光譜掃描（300～700 nm）。

1.3.3 滑子菇多糖的生物活性探究

1.3.3.1 制備脾細(xì)胞[13-14]8～10 周齡的小鼠眼球放血，脫頸致死，于75%酒精內(nèi)浸泡殺菌5 min，轉(zhuǎn)移超凈臺內(nèi)取脾臟，先用hanks 液清洗干凈，后轉(zhuǎn)到200 目鋼網(wǎng)及培養(yǎng)皿內(nèi)研磨， 直至hanks 液發(fā)白為止。然后將培養(yǎng)皿中懸液1 000 r/min 離心10 min，3 倍體積紅細(xì)胞裂解液裂解2 min 去除紅細(xì)胞，hanks 液清洗沉淀3 次，最后1 mL 含10%無支原體新生牛血清RPMI 1640 培養(yǎng)液重懸，離心后靜置3 min。 取出上述細(xì)胞懸液0.1 mL 于小離心管中，臺盼藍(lán)染色1 min 后，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×106個/mL。 臺酚藍(lán)染色檢測細(xì)胞存活率大于95%。

1.3.3.2 滑子菇多糖對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用 采用MTT 法觀察PNP 對小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用[15-16]。將上述制備好的脾細(xì)胞懸液，取40 μL 加入96 孔培養(yǎng)板中，試驗(yàn)隨機(jī)分為空白組、模型組和多糖試驗(yàn)組（多糖終質(zhì)量濃度分別為800，400，200，100，50 μg/mL），每組6 個復(fù)孔，其中試驗(yàn)組與模型組均加入8 μL ConA（終濃度為5 μg/mL）， 最后用RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整總體積至160 μL，96 孔培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h， 在終止培養(yǎng)前4 h， 各孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后取出，加入80 μL 甲瓚溶解劑[17]（14%SDS+50%DMF pH=4.7）培養(yǎng)過夜， 用酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光值并計算其增殖率，計算公式如下：

1.3.3.3 滑子菇多糖對H2O2損傷脾細(xì)胞的保護(hù)作用 按上述方法制備細(xì)胞懸液， 取40 μL 加入96 孔培養(yǎng)板中， 試驗(yàn)隨機(jī)分為空白組、H2O2損傷組和多糖保護(hù)組（多糖終質(zhì)量濃度分別為40，20，10，5，2.5 μg/mL），每組6 個復(fù)孔。 其中H2O2終濃度為400 μmol/L，無菌PBS 稀釋，過膜除菌，最后調(diào)整96 孔板總體積至160 μL， 置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中損傷2 h 后，利用MTT 法測570 nm處吸光值。 根據(jù)公式計算多糖對H2O2引起的脾細(xì)胞損傷的保護(hù)率，計算公式如下：

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 利用Excel 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNP 的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 紅外光譜測定 紅外光譜（IR）是指波數(shù)為4 000～400 cm-1的中紅外區(qū)，根據(jù)樣品在紅外區(qū)的吸收，可尋找多糖特征官能團(tuán)，用于研究糖類化合物中的醛糖、酮糖的糖環(huán)構(gòu)象及糖苷鍵的構(gòu)型等。

PNP 紅外光譜結(jié)果如圖1 所示，3 400 cm-1是O-H 的伸縮振動峰。 2 926 cm-1的吸收是由-CH2-基團(tuán)的C-H 伸縮振動引起的。 1 643 cm-1是-CHO的C=O 伸縮振動峰。1 420～1 385 cm-1的吸收峰是由于C-H 的變角振動引起的。 對于特征吸收峰出現(xiàn)在1 200～1 000 cm-1范圍內(nèi)的多糖，屬于吡喃環(huán)中的伸縮振動， 其在該區(qū)域譜峰的位置和強(qiáng)度都具有專一性，1 072 cm-1處是糖環(huán)中C-O-C 中C=O 伸縮和變角振動引起的。 且PNP 在1 740 cm-1處無糖醛酸對應(yīng)的特征吸收峰，說明PNP 多糖不含糖醛酸[18]。

2.1.2 核磁共振圖譜分析核磁共振（NMR）用來判斷糖類化合物的糖苷鍵構(gòu)型、糖環(huán)構(gòu)象、糖殘基順序、糖苷鍵位置等。多糖類物質(zhì)的1H NMR 中質(zhì)子信號的分布處于很窄的范圍內(nèi)， 而且有著復(fù)雜的偶合關(guān)系。 大多數(shù)多糖中1H 信號多集中在δ 3.2～5.5 mg/L 這個范圍內(nèi)。 在一般情況下，分布在δ4.3～5.5 mg/L 范圍內(nèi)的質(zhì)子信號容易分析， 而其他區(qū)間內(nèi)的信號共振容易發(fā)生重疊交叉， 難以解析。 并且δ4.3～5.5 mg/L 為異頭碳質(zhì)子（C1-H）共振區(qū)， 通常來說該區(qū)內(nèi)有幾個異頭碳質(zhì)子就代表有幾種單糖構(gòu)型。

如圖2 所示是PNP 的核磁氫譜圖。 PNP 在異頭碳質(zhì)子共振區(qū)內(nèi)有5 個不同強(qiáng)度的共振吸收峰，化學(xué)位移分別為5.09，4.95，4.70，4.464.42 mg/L，從左至右依次標(biāo)記A-E，除δ4.70 mg/L 是溶劑D2O 的殘余氫峰外， 其余4 個共振吸收峰就代表了PNP 由4 種單糖組成，與之前的單糖組成測定結(jié)果相符[10]。 此外，化學(xué)位移大于δ5.0 mg/L 異頭質(zhì)子一般是α 型糖苷鍵的共振信號， 而小于δ5.0 mg/L 為β 型糖苷鍵。從氫譜圖中可知，PNP 是由α和β 兩種糖苷鍵構(gòu)型組成， 但是異頭碳上氫的化學(xué)位移只有一個大于δ5.0 mg/L， 其化學(xué)位移為δ5.09 mg/L，表明PNP 是以β 型糖苷鍵為主。并且在δ2.0～2.4 mg/L 沒有信號吸收峰，說明PNP 不含乙?；?。

圖1 PNP 紅外光譜Fig.1 FT-IR spectrum of PNP

圖2 PNP 核磁圖譜Fig.2 1H-NMR Spectroscopy of PNP

2.1.3 β-消除反應(yīng) 加入0.4 mol/L 的NaOH 與不加NaOH 溶液的滑子菇多糖溶液進(jìn)行掃描結(jié)果比較，如圖3 所示。

由圖3 可知， 經(jīng)稀堿處理后的PNP 溶液在240 nm 處吸收下降，是因?yàn)镻NP 中不含有O-糖苷鍵，經(jīng)過堿處理沒有產(chǎn)生α-氨基丙烯酸和α-氨基丁烯酸，所以說明了PNP 中不含O-糖苷鍵。

2.1.4 剛果紅試驗(yàn) 剛果紅（Cnogoerd）是一種酸性染料， 能夠與具有三股螺旋鏈構(gòu)象的多糖形成絡(luò)合物，之后使剛果紅的最大吸收波長發(fā)生紅移，在濃度一定的NaOH 范圍內(nèi)， 表現(xiàn)為最大吸收波長的特征變化（變成紫紅色），當(dāng)NaOH 濃度大于0.3 mol/L 之后，最大吸收波長逐漸下降。PNP 的剛果紅試驗(yàn)最大吸收波長變化如圖4 所示。

圖3 經(jīng)NaOH 處理前后PNP 紫外光譜Fig.3 UV spectra change of PNP treated by NaOH

圖4 PNP-剛果紅復(fù)合物最大吸收波長的變化Fig.4 Maximum absorption of PNP-Congo red complex in solution with various concentration of NaOH

從圖4 可以看出， 剛果紅溶液最大吸收波長逐漸減小， 與對照的剛果紅溶液相比較，PNP+剛果紅復(fù)合物的最大吸收波長上升， 可能是因?yàn)镻NP 沒有高度有序的螺旋結(jié)構(gòu)解離， 轉(zhuǎn)變成自由卷曲結(jié)構(gòu)，沒能使絡(luò)合物的最大吸收波長下降[19]，但是當(dāng)NaOH 濃度逐漸升高到0.4 mol/L 后，最大吸收波長趨于穩(wěn)定，這表明PNP 中可能不存在螺旋構(gòu)象。

2.1.5 碘-碘化鉀反應(yīng) PNP 溶液與碘試劑混勻后進(jìn)行紫外可見光譜掃描如圖5 所示，PNP 與碘試劑的反應(yīng)物最大吸收峰在356 nm 處，而在565 nm 處無最大吸收峰， 說明PNP 可能存在較長的側(cè)鏈和較多的分枝。

2.2 PNP 對小鼠脾淋巴細(xì)胞免疫活性的影響

圖5 經(jīng)I2-KI 處理后PNP 紫外光譜圖Fig.5 UV-Vis spectrum after PNP reacted with I2-KI

2.2.1 PNP 對小鼠T 淋巴細(xì)胞增殖的影響 免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答的一個重要系統(tǒng)，淋巴細(xì)胞則是參與機(jī)體免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞[20]。脾臟淋巴細(xì)胞中含有T、B 淋巴細(xì)胞，它們均是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞， 其中ConA 是T 淋巴細(xì)胞的有絲分裂原，作用于T 細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體，主要促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)PNP 對T 淋巴細(xì)胞的增值作用結(jié)果如表1 所示。

由表1 可知，PNP 協(xié)同ConA 促進(jìn)了小鼠脾T淋巴細(xì)胞的增殖， 其增殖率隨著多糖濃度的增加表現(xiàn)出先升高后降低，50，100 μg/mL 的PNP 抑制了脾淋巴細(xì)胞的增殖，200，400，800 μg/mL 的PNP不同程度地促進(jìn)了T 淋巴細(xì)胞的增殖， 在多糖質(zhì)量濃度為400 μg/mL 時，達(dá)到了最大增殖率5.93%。由此表明，PNP 可能作為T 淋巴細(xì)胞的有絲分裂原促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖進(jìn)而對機(jī)體起到了免疫調(diào)節(jié)作用。

表1 PNP 對T 淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of PNP on proliferation of T lymphocyet

2.2.2 PNP 對H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用 H2O2是重要的活性氧物質(zhì)，極容易透過細(xì)胞膜，通過代謝作用產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的自由基， 從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化、DNA 損傷等， 被廣泛的應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷[21]。 研究發(fā)現(xiàn)多糖對損傷細(xì)胞的保護(hù)作用主要是因?yàn)槎嗵悄軌蚯宄p氧水所產(chǎn)生的自由基[22]，本試驗(yàn)PNP 對H2O2損傷脾細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果如表2 所示。

表2 不同濃度PNP 對細(xì)胞保護(hù)率的影響Table 2 Effects of different doses of PNP on protective percent of the cells

由表2 可知，PNP 對H2O2損傷的脾細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。 隨著PNP 濃度的增加，保護(hù)作用逐漸增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)存在著劑效關(guān)系，在多糖質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時，達(dá)到最大保護(hù)率54.66%。 由此可以說明，本試驗(yàn)PNP 是良好的自由基清除劑，可有效保護(hù)自由基存在下的細(xì)胞，避免細(xì)胞死亡及組織損傷。

3 結(jié)論

本文通過水提醇沉、Sevage 法除蛋白獲得的PNP 進(jìn)行了研究。結(jié)構(gòu)測定結(jié)果表明，一級結(jié)構(gòu)測定分析PNP 具有多糖的特征吸收峰， 是不含O-糖苷鍵的黏多糖， 主要以β 型糖苷鍵為主不含乙?；?、糖醛酸的吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)，核磁氫譜分析出PNP由4 種單糖組成。 高級結(jié)構(gòu)分析PNP 可能不具有螺旋構(gòu)象，但具有較長的側(cè)鏈和較多的分枝構(gòu)型。在體外免疫活性測定了多糖對淋巴細(xì)胞增殖以及H2O2損傷的保護(hù)作用，結(jié)果表明，PNP 對淋巴細(xì)胞有增殖作用，在多糖質(zhì)量濃度為400 μg/mL 時，達(dá)到了最大增殖率5.93%，而對H2O2損傷的保護(hù)在最佳質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時， 達(dá)到最大保護(hù)率54.66%。 綜上對PNP 結(jié)構(gòu)及免疫活性的研究為進(jìn)一步做深入構(gòu)效關(guān)系機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)， 對于開發(fā)免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和功能性保健食品的開發(fā)提供了依據(jù)。