二維液相色譜同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中多種脂溶性維生素

趙玉富，劉曉玲，咸偉玥，王劍飛，單藝

（1.黑龍江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，哈爾濱1500501；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，哈爾濱150028）

0 引 言

嬰幼兒配方乳粉是指以乳類及乳蛋白制品和/或大豆及大豆蛋白制品為主要原料，加入適量的維生素、礦物質(zhì)和/或其他輔料，僅用物理方法生產(chǎn)加工制成的粉狀產(chǎn)品[1-2]嬰幼兒配方乳粉的營(yíng)養(yǎng)成分及含量一般都參照母乳進(jìn)行合理的配方加工生產(chǎn)。近年來嬰幼兒配方乳粉的營(yíng)養(yǎng)成分和產(chǎn)品質(zhì)量備受關(guān)注，2016年3月15日經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局局務(wù)會(huì)議審議通過《嬰幼兒配方乳粉產(chǎn)品配方注冊(cè)管理辦法》，2016年6月6日發(fā)布，10月1日實(shí)施。2019年2月1日，市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布《市場(chǎng)監(jiān)督管理總局關(guān)于印發(fā)2019年食品安全監(jiān)督抽檢計(jì)劃的通知》明確每月對(duì)全部已獲配方注冊(cè)且在售的國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品進(jìn)行抽檢，所以嬰幼兒配方乳粉中維生素的檢測(cè)一直是生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)檢部門的重點(diǎn)工作。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法中對(duì)于維生素A、維生素E采用GB 5009.82-2016第一法，維生素D2、維生素D3采用GB 5009.82-2016第四法，β-胡蘿卜素的檢驗(yàn)采用采用GB 5009.83-2016，實(shí)際檢驗(yàn)效率很低[3-4]。

嬰幼兒配方乳粉中維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3及β-胡蘿卜素均為脂溶性維生素，檢驗(yàn)提取過程相同，但是其中維生素A、維生素E、β-胡蘿卜素為反相高效液相色譜法檢測(cè)，維生素D2、維生素D 3為正相高效液相色譜半制備后由反相高效液相色譜檢測(cè)，操作過程繁瑣。由于嬰幼兒配方乳粉中存在從納克到毫克級(jí)不同含量水平的維生素，各維生素化學(xué)性質(zhì)的差異使得所有維生素的共同提取和分析極具挑戰(zhàn)，此前安捷倫應(yīng)用解決方案和文獻(xiàn)有同時(shí)檢測(cè)多種脂溶性維生素的方法[5-13]。但針對(duì)嬰幼兒配方乳粉的前處理過程不能滿足國(guó)標(biāo)要求。

近年二維液相色譜法發(fā)展迅速，由于其能實(shí)現(xiàn)在一維色譜柱分離復(fù)雜基質(zhì)的微量目標(biāo)物并直接切換到二維色譜柱進(jìn)行精確測(cè)定，實(shí)現(xiàn)了樣品的在線凈化，提高了分析靈敏度，成為了復(fù)雜基質(zhì)樣品檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。本文采用雙泵雙檢測(cè)器系統(tǒng)以六通閥切換一維色譜柱的分離物經(jīng)捕獲柱進(jìn)入二維色譜柱檢測(cè)實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方食品中的五種脂溶性維生素。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

二維液相色譜系統(tǒng)及其色譜工作站（1260 Infinity-2D，Agilent Technologies美國(guó)，配備雙二極管陣列檢測(cè)器），電子分析天平（BSA 2202S 0.01 g、BT 25S 0.01 mg賽多利斯），恒溫?cái)嚢杷″仯℉L-9、上海浦東物理光學(xué)儀器），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA、上海亞榮生化儀器）維生素A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度95.0%，Dr Ehrenstorfe），β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度93.0%，Dr Ehrenstorfe），維生素D2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度98.0%，Dr Ehrenstorfe），維生素D3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.9%，Dr Ehrenstorfe），維生素E標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（dl-α-生育酚，純度98.0%，Dr Ehrenstorfe），甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical），石油醚（沸程30～60分析純，科密歐），無水乙醇（分析純，科密歐），氫氧化鉀（分析純，西隴科技），抗壞血酸（分析純，西隴科技），2，6-二叔丁基対甲酚（分析純，西格瑪），試驗(yàn)用水為超純水。嬰幼兒配方乳粉（市售）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的選擇

C18色譜柱為國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)分析脂溶性維生素選擇，考慮到檢驗(yàn)的分離效果和時(shí)間成本本實(shí)驗(yàn)選擇Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8作為一維分離柱，C8相對(duì)于C18有著更快的分離時(shí)間，而Poroshell 120系列色譜柱采用安捷倫公司專利的制造工藝，在實(shí)心核外包上表面多空層，能顯著提高被分析物在固定相和流動(dòng)相之間的傳質(zhì)，使其在較低反壓下實(shí)現(xiàn)快速高效的分離。二維色譜柱選擇Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH考慮到分離維生素D2和維生素D3的分離度，在相同流動(dòng)相條件下PAH色譜柱可通過降低柱溫實(shí)現(xiàn)維生素D2和維生素D3的基線分離。

維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3均能溶解于甲醇、乙腈中，而β-胡蘿卜素不溶于甲醇、乙腈，易溶于三氯甲烷、四氫呋喃。實(shí)驗(yàn)選擇乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）溶解樣品提取物能同時(shí)溶解5種被測(cè)維生素。同時(shí)對(duì)于一維色譜柱的分離需要進(jìn)行梯度洗脫，三氯甲烷與水不混溶，因此在同時(shí)分離維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D3及β-胡蘿卜素時(shí)選擇乙腈/甲醇/四氫呋喃作為流動(dòng)相。對(duì)于一維色譜柱必須以梯度洗脫使維生素A的出峰時(shí)間延后使其與干擾物質(zhì)分離，對(duì)于二維色譜柱比較流動(dòng)相對(duì)維生素D2和維生素D3分離效果的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用純甲醇作為二維流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物響應(yīng)值最高，以甲醇為流動(dòng)相會(huì)造成目標(biāo)物出峰過快，因此二維色譜柱選用柱長(zhǎng)250 mm的色譜柱。

維生素A、維生素E和β-胡蘿卜素在嬰幼兒配方乳粉中含量較高，維生素D2和維生素D3含量較低，且樣品基質(zhì)干擾較大，原標(biāo)準(zhǔn)方法需經(jīng)過正相制備色譜的凈化，將含有維生素D2和維生素D3的餾分蒸干定容后，再在反相色譜上進(jìn)行分析。本研究采用二維色譜分離的中心切割法，樣品在一維色譜柱實(shí)現(xiàn)初步分離后，將含有維生素D2和維生素D3的餾分切割至二維色譜柱中進(jìn)行分離。系統(tǒng)連接圖（見圖1）。為確定閥的準(zhǔn)確切換時(shí)間，實(shí)驗(yàn)將關(guān)閉閥切換命令使一維色譜柱直接與一維檢測(cè)器連接，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定維生素D2和維生素D3的出峰時(shí)間起點(diǎn)和終點(diǎn)。由于使用捕獲柱收集一維色譜柱的維生素D2和維生素D3的餾分，而捕獲柱柱容量小，需要考慮在閥切換的時(shí)間段內(nèi)捕獲柱是否能完全將維生素D2和維生素D3收集到。由圖1可知影響維生素D2和維生素D3是否被完全收集的因素主要有兩點(diǎn)，一是一維色譜柱對(duì)維生素D3的分離效果，二是一維泵系統(tǒng)的流速設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)中我們內(nèi)徑3.0 mm、填料粒徑2.7μm的一維色譜柱，流速為0.6 mL/min，由標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試確定出閥切換時(shí)間為7.80 min更改閥的位置端口1-＞6，8.90 min更改閥的位置端口1-＞2。

一維條件：Agilent Technologies InfinityLab Poroshell 120 EC-C8（3.0 mm×150 mm，2.7μm），流速為0.6 mL/min梯度洗脫，洗脫程序見表1。一維DAD檢測(cè)器采用波長(zhǎng)切換方式檢測(cè)（VA∶326 nm；VE∶285 nm；β-胡蘿卜素450 nm）。二維條件：Agilent Technologies Zorbax Eclipse PAH（4.6 mm×250 mm，5μm），流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相為甲醇。二維DAD檢測(cè)器檢測(cè)（VD2VD ∶3264 nm），柱溫均為25℃，進(jìn)樣量為10μL，閥切換時(shí)間為7.80 min更改閥的位置端口1-＞6，8.90 min更改閥的位置端口1-＞2。捕獲柱為SB-C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）。

圖1 二維液相閥切換流路示意圖

表1 一維液相梯度洗脫程序

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取一定量的維生素A、維生素E、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻。經(jīng)校正維生素A貯備液濃度為500μg/mL；維生素E標(biāo)準(zhǔn)貯備液濃度為1 000μg/mL；維生素D2貯備液濃度為100μg/mL；維生素D3貯備液濃度為100μg/mL；稱取一定量的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，混勻，經(jīng)校正β-胡蘿卜素貯備液濃度為500μg/mL；分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液適量，以流動(dòng)相B乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）稀釋成混合工作液，維生素A工作液濃度為20.0μg/mL；維生素E標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為200μg/mL；維生素D2工作液濃度為1.00μg/mL；維生素D3工作液濃度為1.00μg/mL；β-胡蘿卜素工作液濃度為10.0μg/mL。將維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.2.3 樣品測(cè)定

根據(jù)相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)稱取嬰幼兒配方乳粉樣品5.00 g（精確至0.01 g）于250 mL錐形瓶中，加入1 g抗壞血酸，50 mL溫度50℃的水充分溶解樣品，加入0.5 g木瓜蛋白酶，蓋上瓶塞于55℃的水浴中磁力攪拌30 min。向預(yù)處理后的試樣中加入80 mL無水乙醇和30 mL氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞于55℃的水浴中磁力攪拌回流皂化30 min。將皂化液移至500 mL分液漏斗中，以石油醚萃取兩次次，每次100 mL，合并萃取液，萃取液以水洗滌至中性，收集石油醚層，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移至旋蒸瓶中。40℃旋蒸至近干，取下氮?dú)獯蹈?，再以流?dòng)相B乙腈/甲醇/四氫呋喃（75∶25∶5，體積比）溶解并轉(zhuǎn)移定容至10 mL作為待測(cè)液。

2 結(jié)果

2.1 方法線性范圍與精密度

按照2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線配制維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)維生素A、E、D2、D3、β-胡蘿卜素加標(biāo)樣品重復(fù)進(jìn)樣六次，以峰面積計(jì)算方法精密度，方法精密度良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍、線性方程及精密度見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液線性關(guān)系與精密度

2.2 樣品分析結(jié)果

按照2.2.3樣品測(cè)定方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行分析，標(biāo)樣譜圖見圖2，樣品分析譜圖見圖3，采用波長(zhǎng)切換模式在一維檢測(cè)器中同時(shí)測(cè)定的維生素A、維生素E及β-胡蘿卜素出峰位置無干擾峰，二維檢測(cè)器中的維生素D2和維生素D3與干擾峰分離度很高，不會(huì)對(duì)結(jié)果造成影響。

圖2 維生素A、維生素E、維生素D 2、維生素D3及β-胡蘿卜素標(biāo)樣譜圖

圖3 樣品中維生素A、維生素E、維生素D2、維生素D 3及β-胡蘿卜素譜圖

表3 樣品測(cè)試結(jié)果與加標(biāo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 國(guó)標(biāo)法與本研究的比較

對(duì)市售嬰幼兒配方乳粉中維生素質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)試并同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品的五種維生素做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表3，實(shí)驗(yàn)樣品中不含維生素D2，其余4種維生素實(shí)測(cè)值偏差5種維生素加標(biāo)回收率在90%～98%之間。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié) 論

本方法實(shí)現(xiàn)維生素A、維生素E、β-胡蘿卜素及維生素D2、維生素D3同時(shí)檢測(cè)，并且維生素D2與維生素D3分離度高，相對(duì)于正相高效液相色譜半制備檢測(cè)分析時(shí)間縮短為25 min，免去了正相制備過程的大量試劑消耗。方法線性范圍為：維生素A為0.0945μg/mL～14.17μg/mL，維生素E為1.21μg/mL～181.5μg/mL，β-胡蘿卜素為0.0163μg/mL～2.445μg/mL，維生素D2為 0.0163μg/mL～2.445μg/mL，維生素 D3為0.0150μg/mL～2.500μg/mL，相關(guān)系數(shù) r均大于0.999。本方法實(shí)現(xiàn)了5種維生素同時(shí)檢測(cè)，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，為嬰幼兒配方乳粉中維生素含量測(cè)定提供了參考。