腸膜明串珠菌產(chǎn)葡聚糖與低聚糖及其產(chǎn)物應(yīng)用研究進(jìn)展

王小杰，張華，2，陳其欣，王星，張淼，談重芳

（1.鄭州大學(xué)河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州450052；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州450046；3.鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院，鄭州450001）

0 引 言

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶反應(yīng)陰性的細(xì)菌統(tǒng)稱。乳酸菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、食品和醫(yī)藥等重要領(lǐng)域有極高的應(yīng)用價(jià)值。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是乳酸菌明串珠菌屬中最常見的一個(gè)種，其是一類不產(chǎn)生孢子，G+C含量低于50%，兼性厭氧且過氧化氫酶呈陰性的革蘭氏陽性細(xì)菌。腸膜明串珠菌可以細(xì)分為4個(gè)亞種：L.mesenteroides subsp.mesenteroides、L.mesenteroides subsp.dextranicum、L.mesenteroides subsp.cremoris、L.mesenteroides subsp.Suionicum[1]。腸膜明串珠菌在生長(zhǎng)代謝過程中，能生成葡聚糖蔗糖酶，又稱為右旋葡聚糖蔗糖酶，是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，通常為胞外酶，屬于誘導(dǎo)性酶[2]。葡聚糖蔗糖酶可以以蔗糖為底物，催化合成高分子量的葡萄糖聚合物即葡聚糖，但也可以在受體分子如麥芽糖存在的情況下催化合成低分子量的糖類聚合物即低聚糖。葡聚糖和低聚糖在醫(yī)藥、食品和石油等行業(yè)都具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 葡聚糖

葡聚糖為同源多糖，是最早被發(fā)現(xiàn)的微生物多糖，也是世界上第一個(gè)工業(yè)化生產(chǎn)的微生物多糖，其商品名被稱為右旋糖酐。葡聚糖最為常見的結(jié)構(gòu)有兩種：α-D-葡聚糖，主鏈由α-D-吡喃葡萄糖單體構(gòu)成，含有大于50%的α-1，6-糖苷鍵，支鏈含α-1，4，α-1，3，或α-1，2-糖苷鍵，一般由細(xì)菌合成，可以用作血漿補(bǔ)充劑；β-D-葡聚糖，主鏈由葡萄糖殘基以β-1，3鍵連接，以β-1，2鍵形成分支，可用于化妝品和食品等行業(yè)[2]。工業(yè)上一般用腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)葡聚糖，不同的菌種產(chǎn)的葡聚糖的結(jié)構(gòu)也有所不同[3]。目前關(guān)于更適合用于產(chǎn)葡聚糖的腸膜明串珠菌亞種的文獻(xiàn)報(bào)道較少，經(jīng)常用于發(fā)酵合成葡聚糖的腸膜明串珠菌有NRRLB-512FM，NRRLB-640，NRRLB-742，NRRLB-1355，NRRB-1299，E131等，其中國(guó)外葡聚糖的商業(yè)生產(chǎn)菌株為腸膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides NRRLB-512FM[4]。

1.1 腸膜明串珠菌產(chǎn)葡聚糖的合成機(jī)理

腸膜明串珠菌發(fā)酵法產(chǎn)葡聚糖分兩步進(jìn)行，即酶的產(chǎn)生與葡聚糖的合成。兩個(gè)反應(yīng)是連續(xù)進(jìn)行的：首先將蔗糖分解成為一個(gè)與酶連接的葡萄糖基和一個(gè)果糖；然后將前者轉(zhuǎn)移到葡聚糖殘基的C3/C6位置或水分子，形成糖鏈或簡(jiǎn)單的水解蔗糖，果糖為其反應(yīng)過程的副產(chǎn)物[5]。葡聚糖的合成過程是以蔗糖為唯一底物在細(xì)胞外進(jìn)行的，即單糖不進(jìn)入細(xì)胞中，這個(gè)過程必須在葡聚糖蔗糖酶的葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶活性的催化下才能完成，酶活性中心以共價(jià)鍵的形式與蔗糖結(jié)合，蔗糖中的果糖單元被分解出來，同時(shí)形成D-glucosyl-Enzyme，D-glucosyl-Enzyme聚合形成葡聚糖，此過程不需要載體物質(zhì)如糖基-核苷酸和糖基載體脂等的參與。腸膜明串球菌轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)葡聚糖過程如圖1所示。

圖1 腸膜明串球菌轉(zhuǎn)化蔗糖產(chǎn)葡聚糖過程

1.2 腸膜明串珠菌產(chǎn)葡聚糖的研究

近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)葡聚糖的研究越來越深入，發(fā)酵合成葡聚糖的產(chǎn)量受多種條件的控制，通過優(yōu)化腸膜明串珠菌培養(yǎng)基成分或發(fā)酵條件可以提高葡聚糖的產(chǎn)量。Ishida等[6]在2015年的研究中表明p H 5.5～6，溫度為30℃時(shí)是Leuconostoc mesenteroide s NTM 048產(chǎn)葡聚糖的最適條件；李莉[7]等人對(duì)L.mesenteroides subsp.mesenteroides DM 1-2-2的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素法和正交法分析優(yōu)化后最佳的培養(yǎng)基組成為酵母粉20 g/L，蔗糖200 g/L，檸檬酸鈉3 g/L，醋酸鈉1 g/L時(shí)（均為質(zhì)量濃度），產(chǎn)葡聚糖的量為4.21±0.15 g/L，產(chǎn)量較原來提高1.4倍。Skory等[8]對(duì)腸膜明串珠菌生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶進(jìn)行基因重組，提高了重組酶在培養(yǎng)基中的積累量，進(jìn)而加快了葡聚糖的轉(zhuǎn)化速率；范娟[9]等人優(yōu)化了腸膜明串珠菌M 81合成葡聚糖的培養(yǎng)條件，當(dāng)接種量為4.0%，初始pH為8.0，培養(yǎng)溫度為27.0℃時(shí)葡聚糖產(chǎn)量為60.55 g/L。Sawale等[10]從印度傳統(tǒng)發(fā)酵的面糊中分離出一株Leuconostoc mesenteroides，培養(yǎng)基成分優(yōu)化后葡聚糖產(chǎn)量比未優(yōu)化提高了7.7倍，葡聚糖產(chǎn)量為60.30 g/L。王英[11]等人對(duì)腸膜明串珠菌T-L1發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化研究，結(jié)果表明該菌在發(fā)酵溫度為28℃、發(fā)酵時(shí)間為24 h、接種量體積分?jǐn)?shù)為5%、培養(yǎng)基起始pH為6.5時(shí)葡聚糖產(chǎn)量最高為30.12 g/L，比優(yōu)化前提高了41%。

1.3 葡聚糖的應(yīng)用

1.3.1 葡聚糖在醫(yī)藥工業(yè)上的應(yīng)用

葡聚糖進(jìn)入人體后，在人體內(nèi)特定酶的作用下，可水解為低分子量的化合物，而這些低分子量化合物與血漿具有相溶性，并在人體內(nèi)酶的作用下，能很快代謝生成葡萄糖，從而可作為血漿代用品。分子量為20 ku和40 ku的葡聚糖進(jìn)入人體后，具有解除紅細(xì)胞聚集的作用，從而可減少血液黏度而改善微循環(huán)，同時(shí)它還具有一定的補(bǔ)充血容量作用。分子量為70 ku的葡聚糖是臨床上公認(rèn)的、性能優(yōu)良的血漿代用品，用于因燒傷創(chuàng)傷、失血等引起的失血性休克時(shí)具有良好的療效。葡聚糖分子量在2 000 K以上，可以用于控制固體劑型水溶性藥物的水溶性，而分子量在40 ku～170 ku之間的葡聚糖適用于制備立即釋放藥片。Choromanska等[12]結(jié)果表明，β-葡聚糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞無毒性。Sales等[13]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，葡聚糖可能在保護(hù)與白色念珠菌相關(guān)的外陰陰道念珠菌病方面具有重要作用。

1.3.2 葡聚糖在食品工業(yè)上的作用

Majumder等[14]證實(shí) Leuconostoc mesenteroides NRRL B-640產(chǎn)生的葡聚糖有食品凝膠和增稠特性。甜品中大多含有大量容易被致齲菌代謝的單糖或雙糖，而小分子的葡聚糖不能被其代謝，所以能作為惰性膳食甜味劑；分子量較大的葡聚糖可作為一種難以被人體消化吸收的低熱量食品添加劑添加到食品中；葡聚糖所特有的黏稠性和持水性，可以被用作果汁和果醬的增稠劑和穩(wěn)定劑；為了提高啤酒的發(fā)泡性，葡聚糖也可以作為啤酒生產(chǎn)中的泡沫穩(wěn)定劑。

1.3.3 葡聚糖在其他方面的應(yīng)用

葡聚糖可以用作油井鉆泥漿的保水劑和增稠劑應(yīng)用于石油工業(yè)中，比傳統(tǒng)使用的淀粉和CMC增稠劑效果更為優(yōu)良[15]；葡聚糖可作為化妝品的填充料在協(xié)助細(xì)胞附著于環(huán)境基質(zhì)或防止細(xì)胞干燥方面有一定的作用；葡聚糖的衍生物葡聚糖鐵可用于防止貧血癥狀，5%的葡聚糖鐵是目前缺鐵性貧血最理想的藥物[2]。

2 低聚糖

低聚糖是一類由糖苷鍵連接的，由2-10個(gè)單糖構(gòu)成的短鏈糖類聚合物即低聚寡糖，其分子量約為300～2 000 ku。低聚糖難以被腸胃消化吸收，能夠增加腸胃中益生菌的數(shù)量，甜度低，熱量低，基本上不增加血糖和血脂。低聚糖包括異麥芽低聚糖、低聚果糖、低聚半乳糖、環(huán)狀糊精和葡糖基蔗糖等[16].Chung等[17]提出傳統(tǒng)低聚糖的生產(chǎn)技術(shù)僅限于從植物源中提取、酸或酶水解多糖或通過轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)合成，低聚糖也可以通過腸膜明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)，并通過添加麥芽糖等受體來限制聚合物分子量的大小，是一個(gè)新興的市場(chǎng)。常用于發(fā)酵生產(chǎn)低聚糖的腸膜明串珠菌為L(zhǎng).mesenteroides subsp.mesenteroides，其中 L.mesenteroides subsp.mesenteroides6055為產(chǎn)低聚糖的模式菌株。

2.1 腸膜明串珠菌產(chǎn)低聚糖的合成機(jī)理

腸膜明串珠菌除可以利用蔗糖合成大分子葡聚糖之外，還能合成低聚糖。Koepsell等[18]首次闡述了葡聚糖蔗糖酶可以通過“受體反應(yīng)”來合成低聚糖的特征。腸膜明串珠菌產(chǎn)低聚糖過程中接受葡萄糖苷基的單糖、雙糖或其他小分子糖類化合物被稱為“受體”。研究表明在蔗糖存在的條件下，向反應(yīng)介質(zhì)中添加麥芽糖或O-甲基葡萄糖苷等分子時(shí)，葡聚糖蔗糖酶將首先以這些物質(zhì)作為葡萄糖基受體，不再轉(zhuǎn)移葡萄糖殘基到葡聚糖上，而是被轉(zhuǎn)移到這些受體的非還原端。受體與果糖反應(yīng)生成單一產(chǎn)物吡喃果糖-5-葡糖苷并非葡萄糖蔗糖酶的受體，使反應(yīng)結(jié)束從而形成同源的α-1，6和α-1，4低聚糖。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多單糖或雙糖都可以作為受體生成低聚糖，其中麥芽糖和異麥芽糖被證實(shí)為最有效的葡聚糖蔗糖酶受體[19]。葡聚糖蔗糖酶催化受體反應(yīng)過程如圖2所示。

圖2 葡聚糖蔗糖酶催化的受體反應(yīng)

2.2 腸膜明串珠菌產(chǎn)低聚糖的研究

低聚糖具有調(diào)節(jié)腸胃，熱量低，提高機(jī)體免疫力等作用，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)提高腸膜明串珠菌合成低聚糖的產(chǎn)量做了大量實(shí)驗(yàn)研究。Kothari等[20]將來自腸膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶固定在質(zhì)量濃度為1%海藻酸鈉溶液中并與受體麥芽糖反應(yīng)，產(chǎn)生了從三糖到同源五糖的低聚糖；Miller等[21]證實(shí)了蔗糖和麥芽糖的比例與腸膜明串珠菌發(fā)酵合成低聚糖的產(chǎn)量有很大的關(guān)系；張寅[22]等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，蔗糖與麥芽糖比例不同，L.mesenteroides subsp.mesenteroides 6055合成低聚糖的產(chǎn)量也不同，蔗糖與麥芽糖的比例越低則低聚糖的產(chǎn)量越大，當(dāng)蔗糖與麥芽糖的比例為2∶1時(shí)，腸膜明串珠菌合成低聚糖的產(chǎn)量最大。Pereira等[23]研究則表明，蔗糖濃度在150 g/L，葡萄糖與蔗糖比例為0.2時(shí)，低聚糖的合成率可以達(dá)到45%。李婧[16]等人優(yōu)化了L.mesenteroides subsp.mesenteroides 6055、DM 1-2產(chǎn)低聚糖的發(fā)酵條件，優(yōu)化后得到L.mesenteroides subsp.mesenteroides 6055合成低聚糖產(chǎn)量為5.15 g/L，L.mesenteroides subsp.mesenteroides DM 1-2合成低聚糖產(chǎn)量為5.01 g/L。

2.3 低聚糖的功能及應(yīng)用

2.3.1 促進(jìn)腸道益生菌的生長(zhǎng)

由于人體缺乏水解低聚糖的酶，所以低聚糖不能被人體小腸消化吸收，但是可以被人或動(dòng)物腸道中的原生微生物，尤其是雙歧桿菌屬的菌株所利用。大量的研究結(jié)果表明低聚糖能夠顯著刺激益生菌的生長(zhǎng)和繁殖。Molly等[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明低聚果糖可以有效的促進(jìn)雙歧桿菌的生長(zhǎng)；Nagendra等[25]的研究結(jié)果表明嬰兒不食用乳糖其腸道內(nèi)的微生物以大腸桿菌為主，而嬰兒食用乳糖其腸道內(nèi)的微生物則以雙歧桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群。

2.3.2 抑制腸道病原微生物的生長(zhǎng)和繁殖

Pack等[26]研究發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)的雙歧桿菌和乳酸桿菌能代謝利用低聚糖，而其不能被大腸桿菌降解，因此對(duì)腸道微生物菌群有顯著的調(diào)節(jié)作用；Kaplan等[27]的研究表明，低聚糖可以優(yōu)先被腸道內(nèi)的雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌利用。低聚果糖或帶有側(cè)鏈的低聚糖都可以在比較大的程度上提高原生雙歧桿菌在腸道內(nèi)的數(shù)量，從而導(dǎo)致消化道內(nèi)pH值降低，能有效的抑制沙門氏菌和大腸埃希氏菌等病原微生物的生長(zhǎng)和繁殖。

2.3.3 改善對(duì)礦物質(zhì)的吸收

低聚糖能顯著提高大腸中雙歧桿菌的數(shù)量，雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，有利于改善腸道內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)腸道對(duì)鈣、鎂的吸收，防止骨質(zhì)疏松。Vrdamuthu等[28]小鼠低聚糖喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過給小鼠實(shí)施卵巢切除后喂養(yǎng)其低聚糖，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠具有非常高效的吸收鈣質(zhì)的能力，骨中的鈣含量及骨質(zhì)中的灰分重量顯著高于對(duì)照組小鼠。

2.3.4 改善加工食品的特性

低聚糖除了能提高腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量之外，同時(shí)還具有良好的物理化學(xué)特性，如耐酸耐熱性好、水分活度低、保濕性強(qiáng)、低熱量值、甜度低、味道圓潤(rùn)柔和等。Nguyen等[29]在橙汁中添加Leuconostoc mesenteroides 512FMCM發(fā)酵合成低聚糖，使橙汁的熱量降低為1032.7 k J/L。低聚糖能廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)，例如能應(yīng)用于功能性食品以及飲料、乳制品、酒類和糕點(diǎn)的生產(chǎn)，以延長(zhǎng)食品貨架期，延緩淀粉老化等。

3 展望

本文綜述了腸膜明串珠菌在生長(zhǎng)代謝過程中通過葡聚糖蔗糖酶的作用催化生成葡聚糖和低聚糖的合成機(jī)理及國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，葡聚糖和低聚糖的應(yīng)用等。葡聚糖和低聚糖在醫(yī)藥、食品、石油等行業(yè)都具有重要的作用，近年來隨著糖生物學(xué)的不斷發(fā)展，許多研究者致力于將腸膜明串珠菌發(fā)酵應(yīng)用于制備分子量可控的葡聚糖和低聚糖，使其適用于各個(gè)領(lǐng)域，提升應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)還需要尋求一種高效的葡聚糖和低聚糖分離純化技術(shù)，這也是葡聚糖和低聚糖的重點(diǎn)發(fā)展方向之一。相信在不久的未來，隨著基因工程技術(shù)，固定化技術(shù)，酶工程技術(shù)的快速發(fā)展，將大幅度提升葡聚糖和低聚糖的生產(chǎn)效率，滿足醫(yī)藥、食品業(yè)、石油工業(yè)、保健品、化妝品等多個(gè)行業(yè)的要求。