以免疫納米微球為凝集原的犬細(xì)小病毒2型抗體凝集檢測方法的建立

唐 毓，蘇瑞紅，侯美佳，孫思萌，馮啟崢，董秀梅,2，張 萍,2，師東方,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.農(nóng)業(yè)部動物疫病病原生物學(xué)東北科學(xué)觀測實(shí)驗站，黑龍江哈爾濱150030)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒2型(Canine parvovirus type 2，CPV-2)引起的，以發(fā)熱、嘔吐、出血性腸炎和幼犬心肌炎為主要特征的接觸性傳染病，對幼犬的危害尤為嚴(yán)重[1]。CPV-2無囊膜，基因組為單股負(fù)鏈DNA，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2和結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[2]。VP2是病毒的主要衣殼蛋白，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病毒中和抗體，為該病免疫防制和診斷研究中的重要靶蛋白[3-4]。疫苗免疫是預(yù)防該病的主要措施，但在臨床上常見免疫犬發(fā)病的病例，其原因除疫苗株與感染株抗原性存在差異外，母源抗體或免疫抗體干擾也是造成免疫失敗的主要原因[5]。因此，監(jiān)測CPV-2抗體水平，不僅有助于確定最佳免疫時機(jī)，還可以及時評估免疫效果。檢測CPV-2抗體常用的方法有血凝抑制試驗(HI)、血清中和試驗(SN)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等[6-7]，但這些方法由于操作復(fù)雜，耗時費(fèi)力，有散毒風(fēng)險或需要特殊儀器，不適于臨床應(yīng)用。國內(nèi)寵物醫(yī)院雖然有進(jìn)口試劑盒檢測CPV-2抗體，但價格昂貴，因此很少有犬接種疫苗前檢測CPV-2抗體水平，多數(shù)犬的免疫程序是憑經(jīng)驗制定的，缺乏抗體檢測依據(jù)。

間接凝集試驗是一種簡便、快速用于病原或抗體檢測的血清學(xué)方法，常以紅細(xì)胞、聚苯乙烯乳膠等作為載體[8-9]。近年來，彩色聚苯乙烯、二氧化硅等納米微球在凝集試驗中的應(yīng)用[10-12]，使得凝集現(xiàn)象更明顯，易于判定，值得借鑒。本研究以重組VP2蛋白致敏彩色聚苯乙烯納米微球，建立檢測CPV-2抗體的間接凝集試驗，為幼犬母源抗體或免疫犬抗體檢測提供一種快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的方法。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗材料 F81細(xì)胞、犬腺病毒(CAV)陽性血清、狂犬病病毒(RABV)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所曲連東研究員提供；CAV分離株CPV-DN17-1(New CPV-2a，病毒滴度為103.6TCID50/0.1 mL)、兔抗CPV-2陽性血清、分別用衛(wèi)佳伍犬五聯(lián)疫苗(美國碩騰，CPV NL-35-D株)、寵必威二聯(lián)苗(荷蘭英特威，CPV C-154株)、犬五聯(lián)疫苗(吉林五星，CPV CR86106株)、犬六聯(lián)疫苗(法國梅里亞，CPV B114株)4種常規(guī)弱毒疫苗免疫成年犬獲得的犬血清、CPV-2陰性血清、犬瘟熱病毒(CDV)陽性血清、質(zhì)粒pGEX-6P-1均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病教研室分離制備或保存；40份CPV-2弱毒疫苗免疫犬血清采自哈爾濱鐵路局警犬基地和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院；病毒DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA聚合酶購自全式金公司；pMD-19T Simple載體、限制性內(nèi)切酶購自寶生物(大連)有限公司；山羊抗兔IgGHRP購自北京中杉金橋有限公司；粒徑為410 nm的彩色聚苯乙烯微球購自上海濤宇微球有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCL)購自哈爾濱百杰斯生物公司；ImmunoCombCanine VacciCheck試劑盒(以色列，Dot-ELISA，以下簡稱CPV抗體檢測試劑盒)購自哈爾濱中興動物醫(yī)藥有限公司；谷胱甘肽(GST)標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照CPV-DN17-1和Gen-Bank中CPV-2 VP2基因序列(KT156835)主要抗原保守區(qū)的截短片段svp2(1 093 bp～1 458 bp，366 bp)，應(yīng)用軟件Primer 5設(shè)計引物：sVP2-F：5'-CGGGA TCCCAAACAGATGAAAATCAAGCAG-3'(BamHⅠ)/sVP2-R：5'-CCGCTCGATGCATTTACATGAAGTCTT GG-3')(XhoⅠ)。

1.3svp2基因的PCR擴(kuò)增 參照病毒基因組提取試劑盒說明書提取CPV-DN17-1 DNA作為模板，以sVP2-F/sVP2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃10 min。膠回收PCR產(chǎn)物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序后克隆至經(jīng)BamHⅠ/XhoⅠ處理的pGEX-6P-1中，經(jīng)酶切和測序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pGEX-svp2。

1.4 重組蛋白rsVP2的表達(dá)與鑒定 將pGEX-svp2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定正確的重組菌按1:50接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h后，1 200 r/min離心收集菌體，超聲裂解后取上清和沉淀經(jīng)SDS-PAEG分析重組蛋白的大小及表達(dá)形式。

參照GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說明書純化重組蛋白后，SDS-PAGE檢測該蛋白的純化效果。以兔抗CPV-2陽性血清(1∶500)為一抗，山羊抗兔IgGHRP(1∶5 000)為二抗，采用western blot分析重組蛋白的反應(yīng)原性。鑒定正確的重組蛋白命名為rsVP2。

1.5 CPV-2抗體間接凝集檢測方法的建立 采用方陣法優(yōu)化制備致敏微球，首先固定納米微球的量為 25 μL(5%w/v)。分別取 1 mL醋酸鹽緩沖液(pH5.0)稀釋的不同濃度的 rsVP2(0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg/mL、0.4 mg/mL、0.5 mg/mL)，分別加入不同量(0.015 g、0.030 g、0.045 g)EDC·HCL，再加入25 μL納米微球(5%w/v)，各成分混勻后，置脫色搖床，100 r/min室溫?fù)u動2 h，8 000 r/min離心15 min，棄上清，加入1 mL乙磺酸緩沖液(MES，pH4.7)充分懸起，相同條件離心15 min后棄上清，用250 μL MES重懸，即為致敏微球，4℃保存。取兔抗CPV-2陽性血清與制備的致敏微球進(jìn)行凝集試驗，確定最佳抗原蛋白rsVP2和EDC·HCL的量。

各取1 mL分別用醋酸鹽緩沖液(pH5.0)、磷酸緩沖液(PBS，pH7.2)、乙磺酸緩沖液(MES，pH4.7)稀釋成優(yōu)化濃度的rsVP2，加入適量的EDC與25 μL納米微球(5%w/v)，混勻，按同樣方法制備致敏微球，根據(jù)凝集試驗結(jié)果確定最佳的致敏緩沖液。

取干凈的載玻片先后滴加10 μL 2倍倍比稀釋的兔抗 CPV-2 陽性血清(1∶2～1∶16)和 10 μL 按優(yōu)化條件制備的致敏微球，混勻，搖晃1 min～2 min并觀察凝集現(xiàn)象。同時以PBS代替檢測血清作為陰性對照。凝集程度判定：“++++”為100%凝集，顆粒大量聚集成團(tuán)，周邊液體清亮；“+++”為75%凝集，顆粒明顯，分散，周邊液體澄清；“++”為50%凝集，密集的小顆粒，周邊液體較清亮；“+”為25%凝集，無明顯凝集顆粒，液體渾濁；“-”液滴呈原有的均勻混濁紅色，無凝集現(xiàn)象。

1.6 特異性試驗 取CDV陽性血清、CAV陽性血清、RABV陽性血清和CPV-2陽性血清分別與致敏微球進(jìn)行凝集試驗，同時設(shè)PBS、CPV-2陰性血清作為陰性對照，檢測該間接凝集試驗的特異性。

1.7 敏感性試驗 隨機(jī)取4種不同的CPV-2弱毒疫苗免疫后采集的犬陽性血清各1份，檢測其中和抗體效價[13]。將上述各陽性血清2倍倍比稀釋(1∶2～1∶16)后利用本研究建立的凝集試驗檢測，使致敏微球呈現(xiàn)50%凝集(++)的血清最低稀釋倍數(shù)對應(yīng)的中和抗體效價即為凝集試驗的最低檢測抗體效價。

利用本實(shí)驗建立的凝集方法檢測20份CPV-2弱毒疫苗免疫犬的陽性血清樣品，同時采用CPV抗體檢測試劑盒(Dot-ELISA)檢測相同血清樣品的CPV-2抗體，評估該凝集方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗 以兔抗CPV-2陽性血清、CPV-2陰性血清、CDV陽性血清和CAV陽性血清為檢測血清，分別與標(biāo)記為A、B、C，批號為1104的3份致敏微球進(jìn)行凝集試驗，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，檢測該方法的批內(nèi)重復(fù)性；將以上述血清分別與批號為1012、1015、1020 3個批次的致敏微球進(jìn)行凝集試驗，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，檢測該方法的批間重復(fù)性；取兔抗CPV-2陽性血清、CPV-2陰性血清、CDV陽性血清和CAV陽性血清分別與4℃保存15 d、30 d、45 d、60 d、90 d的致敏微球進(jìn)行該凝集試驗，檢測致敏微球在不同保存條件下的穩(wěn)定性。

1.9 臨床樣品的檢測 隨機(jī)選取4份CPV-2弱毒疫苗免疫的犬血清，用CPV抗體檢測試劑盒、間接凝集試驗和中和試驗分別檢測并比較檢測的血清抗體效價及三者的相關(guān)性。

另外，利用CPV抗體檢測試劑盒和本研究建立的間接凝集試驗檢測40份采自警犬基地和寵物醫(yī)院的犬血清樣品，分析間接凝集試驗與試劑盒檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rsVP2的表達(dá)、純化及鑒定

2.2 CPV-2抗體間接凝集方法的建立 經(jīng)方陣試驗優(yōu)化該凝集方法的結(jié)果為：致敏微球所用純化的rsVP2的量為0.3 mg，EDC的量為0.015 g，緩沖液為500 μL(pH5.0)醋酸緩沖液，致敏的微球凝集效果最好。根據(jù)凝集試驗結(jié)果，不同凝集程度的判定如圖2。

2.3 特異性試驗結(jié)果 分別采用CPV-2、CDV、CAV、RABV陽性血清進(jìn)行該凝集方法的特異性試驗。結(jié)果顯示，僅CPV-2陽性血清與致敏微球發(fā)生凝集反應(yīng)，其它血清與陰性對照均不與致敏微球發(fā)生凝集反應(yīng)(圖3)。表明該凝集試驗具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 敏感性試驗結(jié)果 經(jīng)中和試驗檢測，4份CPV-2弱毒疫苗免疫的犬血清中和抗體效價分別是1∶5 000、1∶512、1∶625 和 1∶1 111。凝集試驗敏感性試驗結(jié)果顯示，使致敏微球發(fā)生50%(++)凝集的血清最高稀釋倍數(shù)分別為 1∶8、1∶2、1∶2 和 1∶4，對應(yīng)的中和抗體效價分別為 1∶625、1∶256、1∶312 和1∶278，凝集試驗對血清的最低檢出中和效價為1∶256。

利用CPV抗體檢測試劑盒和凝集試驗對20份免疫犬血清樣品的檢測結(jié)果顯示，試劑盒檢測呈陽性的血清(分值≥S3)15份，陰性血清5份(分值＜S3)；凝集試驗檢測該15份陽性血清均呈50%(++)凝集，判定為陽性血清。凝集試驗檢測該5份陰性血清均呈25%(+)或無凝集現(xiàn)象(-)(圖4)。表明本研究建立的凝集方法敏感性較高，且與CPV抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果一致性較高。

2.5 重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果 重復(fù)性試驗結(jié)果顯示，僅兔抗CPV-2陽性血清與同批次制備的(編號：1104)的3份致敏微球A、B、C以及不同批次(編號：1012、1015、1020)制備的致敏微球發(fā)生凝集反應(yīng)，CPV-2陰性血清、CDV陽性血清和CAV陽性血清與同批次以及不同批次制備的致敏微球均不發(fā)生凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)的特異性和凝集程度一致，表明同一批次和不同批次制備的致敏微球的重復(fù)性均較好。

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，僅兔抗CPV-2陽性血清與4℃保存不同時間的致敏微球均發(fā)生凝集反應(yīng)，CPV-2陰性血清、CDV陽性血清和CAV陽性血清均不與其發(fā)生凝集反應(yīng)。特異性和凝集程度與新鮮制備的致敏微球無明顯差別，表明4℃保存90 d的致敏微球仍具有較好的穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果的比較 取4份CPV-2弱毒疫苗免疫的犬血清，分別用CPV抗體檢測試劑盒、間接凝集試驗和中和試驗進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，雖然4份血清的抗體效價不同，但中和抗體效價高的血清，CPV抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果分值也高，發(fā)生凝集反應(yīng)(++)時血清的稀釋倍數(shù)也高；中和抗體效價較低的血清，CPV抗體檢測試劑盒的檢測結(jié)果分值也較低，發(fā)生凝集反應(yīng)(++)的血清稀釋倍數(shù)也較低，3種方法的檢測結(jié)果具有相同的趨勢(表1)。表明，間接凝集試驗檢測結(jié)果可以反映機(jī)體內(nèi)CPV-2抗體產(chǎn)生的趨勢和水平。

采用本研究建立的間接凝集方法和CPV抗體檢測試劑盒檢測40份犬血清樣品的結(jié)果顯示，凝集方法檢測陽性的血清有35份，陰性血清5份；試劑盒檢測陽性的血清有36份，陰性血清4份。凝集方法與CPV抗體檢測試劑盒檢測的陽性結(jié)果符合率為97%(表2)。表明本研究建立的間接凝集方法可以用于臨床檢測犬CPV-2血清抗體。

表1 不同方法檢測的CPV-2抗血清效價結(jié)果

表2 臨床樣品的檢測結(jié)果

3 討論

CPV病主要危害6周齡～20周齡幼犬，目前以疫苗免疫為主要防制措施。研究表明，母源抗體對疫苗免疫有干擾作用，當(dāng)母源抗體的HI效價＞1:20或＜1:80時，幼犬對疫苗無免疫應(yīng)答而導(dǎo)致免疫失敗[14]。因此，在免疫接種前監(jiān)測CPV-2抗體水平對確定最佳免疫時機(jī)，或評估免疫效果是非常必要的。盡管HI試驗操作繁瑣，有散毒風(fēng)險，以及紅細(xì)胞懸液保存時間較短等問題不適于臨床應(yīng)用，但仍認(rèn)為該方法是檢測CPV-2抗體水平的“金標(biāo)準(zhǔn)”。Pollock等研究顯示，幼犬CPV-2抗體HI≥1∶80時可以抵抗 CPV-2 的感染，而 1∶10≤HI＜1∶80 時常導(dǎo)致免疫失敗[15]。目前在寵物醫(yī)院多使用Immuno-CombCanine VacciCheck(以色列)試劑盒檢測CPV-2抗體，但其價格昂貴甚至超過一次免疫的疫苗價格，限制了其在抗體監(jiān)測中的廣泛應(yīng)用。該CPV抗體檢測試劑盒是一種半定量的Dot-ELISA方法，檢測分值≥S3時判定為陽性結(jié)果，此分值對應(yīng)的HI效價≥1:80，即分值≥S3時血清抗體對犬有免疫保護(hù)作用。本研究采用VP2截短蛋白制備的免疫彩色納米微球僅與CPV-2陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，具有較強(qiáng)的特異性。雖然本研究建立的間接凝集試驗不能準(zhǔn)確檢測血清樣品的抗體效價，但從試驗結(jié)果來看，CPV抗體檢測試劑盒檢測分值≥S3的血清樣品，凝集試驗結(jié)果≥++，并且與試驗盒檢測結(jié)果的陽性符合率為97%，表明該凝集試驗可以定性檢測幼犬CPV-2母源抗體和疫苗免疫抗體。

自1978年首次報道CPV-2以來，已經(jīng)陸續(xù)出現(xiàn)了新的亞型變異株CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、new CPV-2a和new CPV-2b，這些變異株的主要突變位點(diǎn)在基因組的第426位和297位氨基酸[16]。本研究中致敏微球所用的重組蛋白是new CPV-2a亞型流行株VP2的aa365～aa486的截短蛋白，其氨基酸序列除第440位的丙氨酸(Ala)與目前常用的CPV疫苗株 NL-35-D(CPV-2a)、C-154(CPV-2a)、B114(CPV-2)和CR86106(CPV-2)該位點(diǎn)的蘇氨酸(Thr)不同外，其余氨基酸序列均相同，抗原性也無明顯不同，這一點(diǎn)在4份不同疫苗免疫犬血清的檢測結(jié)果中可以得到證明。血清中和試驗表明rsVP2的免疫血清對new CPV-2a病毒株具有中和作用，因此，用其作為抗原同樣也可以檢測到血清中和抗體，后者在一定程度反映血清抗體的免疫保護(hù)作用。從對4種疫苗分別免疫的犬血清檢測結(jié)果來看，凝集試驗可以檢測出不同疫苗免疫犬的CPV-2陽性血清，且與CPV抗體檢測試劑盒(Dot-ELISA)、中和試驗的檢測結(jié)果趨勢一致，可以用于目前常用CPV疫苗免疫抗體的檢測。本研究建立的間接凝集試驗具有良好的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，操作簡便、檢測成本低，適用于臨床對犬血清樣品的及時檢測，有助于提高臨床上對CPV抗體監(jiān)測的普及率，為科學(xué)制定CPV疫苗免疫程序提供參考依據(jù)。