MDCK細(xì)胞中IFN-γ誘導(dǎo)的免疫相關(guān)GTP酶在弓形蟲(chóng)PVM表面的定位研究

李 琦，張朝霞，谷昊容，曹 亮，賈洪林*，王春仁

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶163000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150069；3.黑龍江省農(nóng)墾總局動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所黑龍江哈爾濱150036)

剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)為專性細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，可以感染包括人類在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游?，引起重大的人獸共患疾病[1]。全世界約有30%的人口長(zhǎng)期感染弓形蟲(chóng)。弓形蟲(chóng)入侵細(xì)胞時(shí)會(huì)產(chǎn)生納蟲(chóng)空泡(Parasitophorous vacuole，PV)，PV膜(PVM)具有一定的通透性，允許宿主細(xì)胞內(nèi)弓形蟲(chóng)生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及小分子進(jìn)入，同時(shí)隔絕來(lái)自宿主細(xì)胞內(nèi)的其它有害因子，為弓形蟲(chóng)提供有效的屏障[2-3]。PVM不與宿主細(xì)胞的內(nèi)涵體或溶酶體融合，在保護(hù)弓形蟲(chóng)體免受宿主天然免疫系統(tǒng)的殺傷過(guò)程中起到非常重要的作用[4-5]。

抗寄生蟲(chóng)的細(xì)胞免疫主要依靠1型T輔助細(xì)胞(Th1)反應(yīng)，涉及到T細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞等多種細(xì)胞以及干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)等細(xì)胞因子[6]。IFN-γ為CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子[7-9]。在小鼠抗弓形蟲(chóng)感染的細(xì)胞免疫中，IFN-γ可以誘導(dǎo)多種免疫相關(guān)GTP酶(IRGs)和鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GBPs)的表達(dá)，其中，IRGs在結(jié)構(gòu)和功能上分為GMS蛋白和GKS蛋白[10-12]，GMS 類 IRGs(Irgm1、Irgm2、Irgm3)采用missing-self的原理，引導(dǎo)GKS類IRGs(Irga6、Irgb6、Irgb10等)被募集到PVM表面，并引起GBPs的聚集，進(jìn)而使得PVM發(fā)生囊泡化，暴露出其內(nèi)的弓形蟲(chóng)體，使得蟲(chóng)體被宿主細(xì)胞內(nèi)的天然免疫分子識(shí)別、殺傷并清除[13]。

迄今而止，犬細(xì)胞中抵抗弓形蟲(chóng)感染的免疫機(jī)制仍不清楚，其是否也依賴于IRGs對(duì)弓形蟲(chóng)PVM的募集還有待驗(yàn)證。因此，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Irgb11-GFP的MDCK細(xì)胞系，并經(jīng)體外感染弓形蟲(chóng)，研究在IFN-γ誘導(dǎo)的情況下，Irgb11對(duì)弓形蟲(chóng)PVM的影響。本實(shí)驗(yàn)為深入研究宿主抗弓形蟲(chóng)感染的天然免疫機(jī)制以及研究防治弓形蟲(chóng)感染的措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 剛地弓形蟲(chóng)PLK蟲(chóng)株、HFF、HEK293T、MDCK細(xì)胞由哈爾濱獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)室保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、BamHⅠ和XbalⅠ、KOD-Plus-Neo高保真 PCR酶、Blasticidin S Hcl抗生素購(gòu)自TaKaRa公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Vazyme連接試劑盒均購(gòu)自QIAGEN公司；慢病毒載體LentiCas9-Blast、psPAX2、pCMV-VSV-G、pEGFP質(zhì)粒均購(gòu)自Addgene公司；鼠抗 β-actin單克隆抗體(MAb)、山羊抗鼠 IgGHRP、兔抗GFP多克隆抗體、山羊抗兔IgG-HRP、Alexa Fluor 594標(biāo)記的猴抗鼠IgG(H+L)、Alexa Fluor 488標(biāo)記的猴抗兔IgG(H+L)均購(gòu)自Sigma公司；鼠抗GRA7 MAb與PEI轉(zhuǎn)染試劑由哈爾濱獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)免疫實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中Irgb11(NM_001313802)和GFP基因(LN515608.1)序列，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物，分別于Irgb11上游引物和下游引物的5'端添加X(jué)baⅠ(tctaga)和BamHⅠ(ggatcc)酶切位點(diǎn)及與LentiCas9-Blast連接的同源臂(小寫(xiě))，用以分別擴(kuò)增Irgb11和GFP的基因序列。引物均由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成(表 1)。

表1 引物序列

1.3 pLenti-Irgb11-GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定收集培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以該cDNA為模板，采用引物L(fēng)enti-Irgb11-F/Irgb11-GFP-R PCR擴(kuò)增Irgb11基因；以pEGFP質(zhì)粒為模板，以Irgb11-GFP-F/Lenti-GFP-R為引物，PCR擴(kuò)增GFP編碼基因，再以GFP、Irgb11的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后的混合產(chǎn)物為模板，以Lenti-Irgb11-F/Lenti-GFP-R為引物，利用KOD酶進(jìn)行Irgb11-GFP基因的融合PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃ 2 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、68℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；68℃ 7 min。將PCR產(chǎn)物采用Vazyme連接試劑盒克隆至經(jīng)XbaⅠ和BamHⅠ雙酶切的Lenti-Cas9-Blast載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP。

采用引物L(fēng)enti-Irgb11-F/Lenti-GFP-R對(duì)構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。鑒定正確的重組質(zhì)粒由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司雙向測(cè)序并拼接鑒定。

1.4 重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP的慢病毒包裝將 pCMV-VSV-G、psPAX2、pLenti-Irgb11-GFP質(zhì)粒采用PEI試劑共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，6 h后棄去培養(yǎng)液，換用10%FBS的DMEM培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染48 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并收集細(xì)胞培養(yǎng)液[14]，12 000 r/min離心5 min，取上清即為包裝Irgb11-GFP的病毒液，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 過(guò)表達(dá)Irgb11-GFP細(xì)胞系的構(gòu)建與穩(wěn)定傳代采用1.4獲得的包裝的病毒液感染MDCK細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h后利用熒光顯微鏡觀察，如細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光，即向細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)按照5 μg/mL加入Blasticidin S Hcl初步篩選，每隔48 h更換新鮮加藥培養(yǎng)液。5 d后將細(xì)胞消化經(jīng)流式細(xì)胞儀篩選，分選出具有綠色熒光蛋白表達(dá)的細(xì)胞，將分選出的MDCK-Irgb11細(xì)胞在含5%FBS與2%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每2 d傳代一次，共傳10代，每代細(xì)胞均在熒光顯微鏡下觀察是否出現(xiàn)特異熒光；收集第5代的細(xì)胞樣品裂解后，以兔抗GFP多克隆抗體(1∶3 000)與鼠抗 β-actin MAb(1∶3 000)為一抗，山羊抗兔 IgG-HRP(1∶5 000)與山羊抗鼠IgG-HRP(1∶5 000)為二抗經(jīng) western blot鑒定是否構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)Irgb11-GFP的細(xì)胞系MDCK-Irgb11。

1.6 Irgb11蛋白在弓形蟲(chóng)PVM表面的定位檢測(cè)將8×103個(gè) MDCK-Irgb11細(xì)胞接種共聚焦培養(yǎng)皿中，16 h后加入2 ng/mL IFN-γ誘導(dǎo)24 h后接種5×105個(gè)弓形蟲(chóng)PLK蟲(chóng)株，以未經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞為對(duì)照。2 h后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞3次，加入組織固定液固定，利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)，分別以鼠抗 GRA7 MAb(1∶1 000)和兔抗GFP多克隆抗體(1∶3 000)為一抗，以Alexa Fluor 594標(biāo)記的猴抗鼠IgG(H+L)(1∶3 000)與Alexa Fluor 488標(biāo)記的猴抗兔IgG(H+L)(1∶3 000)為二抗。利用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察PLK蟲(chóng)株與Irgb11-GFP蛋白的定位情況。

2 結(jié)果

2.1 pLenti-Irgb11-GFP重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 分別以Lenti-Irgb11-F/Irgb11-GFP-R及Irgb11-GFP-F/Lenti-GFP-R為引物，以MDCK細(xì)胞的cDNA與pEGFP質(zhì)粒為模板分別擴(kuò)增了Irgb11基因與GFP基因。采用KOD酶將Irgb11與GFP基因經(jīng)融合PCR擴(kuò)增后，結(jié)果顯示Irgb11-GFP融合基因片段約為2 000 bp，與預(yù)期片段大小相符(圖1)，表明擴(kuò)增獲得了Irgb11-GFP基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與Lenti-Cas9-Blast載體連接后構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP經(jīng)菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示，在約2 000 bp處有目的條帶，與預(yù)期大小相符(圖2)。鑒定為陽(yáng)性的菌液測(cè)序結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增獲得的基因與Irgb11-GFP融合基因大小相符，表明正確構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP。

2.2 重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP的慢病毒包裝將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLenti-Irgb11-GFP與慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2和pCMV-VSV-G共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后采用倒置熒光顯微鏡觀察HEK293T細(xì)胞有特異的綠色熒光(圖3)。表明Irgb11-GFP融合基因在HEK293T細(xì)胞中獲得表達(dá)。

2.3 過(guò)表達(dá)Irgb11-GFP細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定 采用經(jīng)HEK293T細(xì)胞包裝的表達(dá)Irgb11-GFP的慢病毒，感染MDCK細(xì)胞，48 h后經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有特異性綠色熒光(圖4)。將該細(xì)胞經(jīng)藥物篩選后，采用流式細(xì)胞儀分選出表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞，即獲得Irgb11-GFP蛋白過(guò)表達(dá)的MDCK細(xì)胞，該細(xì)胞傳10代每代均有特異綠色熒光出現(xiàn)。第5代細(xì)胞采用western blot鑒定MDCK-Irgb11細(xì)胞系中Irgb11-GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示，僅MDCK-Irgb11細(xì)胞裂解物中在84 ku處檢測(cè)到蛋白條帶，與預(yù)期Irgb11-GFP蛋白大小相符，而MDCK細(xì)胞無(wú)該特異條帶(圖5)。表明構(gòu)建了Irgb11-GFP過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系。

2.4 Irgb11在弓形蟲(chóng)PVM表面的定位檢測(cè)結(jié)果采用IFA方法分別對(duì)Irgb11-GFP融合蛋白和弓形蟲(chóng)PLK株染色后，經(jīng)共聚焦激光掃描顯微鏡觀察顯示，未經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的MDCK-Irgb11細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白散在分布于細(xì)胞質(zhì)中，未發(fā)生定位，而經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)的MDCK-Irgb11細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光蛋白在弓形蟲(chóng)PLK株的PVM表面發(fā)生聚集(圖6)。表明，融合蛋白Irgb11-GFP與PVM中的GAR7蛋白發(fā)生共定位，由于GAR7蛋白為弓形蟲(chóng)PVM的膜蛋白，由此表明Irgb11-GFP蛋白被募集至PVM上，即經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)后的Irgb11蛋白能夠定位于弓形蟲(chóng)PVM的表面。

3 討論

本研究采用慢病毒包裝載體系統(tǒng)，將Irgb11-GFP基因轉(zhuǎn)入MDCK細(xì)胞基因組中，使其在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。這種新型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可以將外源目的基因有效整合到宿主染色體中，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高，表達(dá)量較高、表達(dá)穩(wěn)定并且作用的宿主廣泛，幾乎可以感染任何類型的細(xì)胞，對(duì)于質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞尤為適用[14]。但是，由于經(jīng)細(xì)胞篩選培養(yǎng)后的Irgb11-GFP蛋白在MDCK細(xì)胞中表達(dá)量較少，在后續(xù)試驗(yàn)中檢測(cè)Irgb11-GFP融合蛋白在弓形蟲(chóng)PVM表面定位時(shí)，觀察到的熒光強(qiáng)度較弱，因此，本實(shí)驗(yàn)采用IFA對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Irgb11-GFP蛋白再染色，放大熒光信號(hào)，以便清晰觀查到Irgb11-GFP蛋白在弓形蟲(chóng)PVM表面的定位情況。

Irgb11基因?qū)儆贗FN-γ誘導(dǎo)的GTP酶基因家族，在鼠源細(xì)胞內(nèi)的研究結(jié)果顯示，其同源蛋白Irgb6經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)后可以定位于弓形蟲(chóng)PVM表面，引導(dǎo)GBP、p62等多種蛋白定位于弓形蟲(chóng)PVM表面，進(jìn)而共同導(dǎo)致弓形蟲(chóng)PVM的囊泡化，暴露出弓形蟲(chóng)體，并被宿主天然免疫機(jī)制識(shí)別并殺傷[15-16]。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)外源Irgb11蛋白，經(jīng)IFN-γ誘導(dǎo)后，利用IFA對(duì)弓形蟲(chóng)PVM中的GAR7致密顆粒蛋白染色后經(jīng)激光共聚焦檢測(cè)Irgb11蛋白在弓形蟲(chóng)PVM的定位情況。結(jié)果顯示，犬MDCK細(xì)胞中表達(dá)的Irgb11被募集到弓形蟲(chóng)PVM中與GAR7蛋白發(fā)生共定位，表明Irgb11與小鼠Irgb6有著相似的募集能力，可能發(fā)揮相似的抗弓形蟲(chóng)功能。據(jù)此推測(cè)，在犬源細(xì)胞內(nèi)GKS類IRGs可能也被募集到弓形蟲(chóng)PVM的表面，形成“攻膜復(fù)合體”結(jié)構(gòu)，但其抑制弓形蟲(chóng)生長(zhǎng)的天然免疫機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。