電針對顱腦損傷大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡的影響*

陳坤黃寓，王 東，楊 歡，王 鑫，折雪妮，王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712000)

顱腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是外科常見的且危及生命的疾患之一，不僅會帶來身體上的殘疾，對大腦學(xué)習(xí)認(rèn)知能力亦會產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，目前，電針對腦損傷的治療作用已取得肯定的療效[1-2]，但對其機(jī)制的研究尚未明確。本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮測試、HE染色及Western印記分析等測定方法，觀察大鼠顱腦損傷前后行為學(xué)及凋亡蛋白caspase-3的變化及電針對其影響，以探討電針對腦損傷大鼠海馬區(qū)的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用SD大鼠60只，體質(zhì)量210～240 g，由成都達(dá)碩試驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號SCXK(川)2015-030，自由飲食，(20±3)℃下飼養(yǎng)，造模前禁食12 h，禁水2 h。

1.2 模型制備及分組

使用改良的Feeny自由落體損傷裝置建立顱腦損傷模型[3]。大鼠被隨機(jī)分為：①假手術(shù)組20只，沿頭頂正中線切開頭皮，在左側(cè)顱骨鉆孔后縫合頭皮，不作打擊；②模型組20只，使用改良的Feeny自由落體裝置打擊左側(cè)大腦，深度約5 mm,后縫合頭皮；③電針組20只，在造模24 h后開始針刺治療。14天后各組分別取材。

1.3 電針處理

在顱腦損傷后第2天，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[4]動物實(shí)驗(yàn)定位取穴，電針大鼠“百會”“大椎”“內(nèi)關(guān)”“足三里”穴。用動物固定架固定大鼠，沿皮下緩慢進(jìn)針，深度5 mm，接通電針儀，正負(fù)極連接前肢與后肢針尾。電針儀用華佗牌SDZ-IIA, 頻率為5～10次/s,疏密波形，強(qiáng)度以大鼠輕微顫抖為度[5]，時間15 min，1次/天，共14天，治療7次后間隔1天繼續(xù)電針治療。

1.4 Morris水迷宮

在造模后第11天，對大鼠進(jìn)行為期5天的學(xué)習(xí)訓(xùn)練。在圓筒形水池裝滿水，分為4個象限，將平臺放置于某個象限，讓大鼠沿池壁下水，攝像機(jī)記錄60 s內(nèi)大鼠登上平臺所需時間(逃避潛伏期)。每只大鼠每天從4個象限分別進(jìn)行1次學(xué)習(xí)訓(xùn)練，若90 s內(nèi)未能登上平臺，則將大鼠引導(dǎo)至平臺以強(qiáng)化記憶15 s。取后3天大鼠逃避潛伏期的均數(shù)為大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績。在第5天訓(xùn)練結(jié)束后，撤離平臺，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)。

1.5 組織灌注和取材

在對大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測試結(jié)束后，對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行取材。每組抽取10只大鼠取新鮮左腦海馬組織，剩余10只大鼠的大腦用石蠟固定用于組織切片。將大鼠麻醉后(10%水合氯醛3.5 mL/kg)固定于動物臺，打開胸腔后用灌注針頭插入大鼠心尖開始灌注生理鹽水，直至大鼠肺臟、肝臟等組織呈白色失血樣。隨后斷頭打開顱腔，用直鑷小心撥開大腦皮質(zhì)，分離左側(cè)海馬，迅速置于-80℃冰箱中保存。用于石蠟切片的腦組織，將海馬剝離后冠狀面切塊置于4%的多聚甲醛溶液中固定，24 h內(nèi)脫水包埋后石蠟切片5 μm備用。

1.6 Western-blot

將海馬稱重，根據(jù)1 mg組織加入6 μL裂解液(含1 mM PMSF)，進(jìn)行組織勻漿，離心機(jī)轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min,提取上清液；按照BCA蛋白濃度試劑盒說明書調(diào)整至蛋白濃度一致；制備SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠(12%分離膠+5%濃縮膠)，電泳分離蛋白；濕法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h,加入兔抗大鼠caspase-3(1∶1 000)，4℃孵育過夜；室溫復(fù)溫1 h，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶500)，室溫孵育1 h;洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯色，拍照記錄。

1.7 HE染色

染色前將石蠟切片在65℃烤箱中烤片1 h，于二甲苯、梯度酒精(100%、95%、90%、80%、75%)中脫蠟，純水沖洗1 min,蘇木素先用濾紙濾過雜質(zhì)，再將切片浸入5 min，純水沖洗1 min,伊紅染色1 min,純水沖洗清除殘留染色液，鏡下觀察染色情況。染色成功后，分別在80%、95%、100%無水乙醇中浸泡數(shù)秒，二甲苯中脫水5 min,中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下拍攝切片海馬CA1區(qū)，觀察該區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的損傷程度和形態(tài)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、空間探索能力比較

相較于第1天，第2天各組的逃避潛伏期均有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在第3～5天期間，模型組的逃避潛伏期明顯較假手術(shù)組更長(P<0.01)，電針組逃避潛伏期時間明顯較模型組更短(P<0.01)；在水迷宮實(shí)驗(yàn)第5天，模型組穿越平臺次數(shù)明顯少于假手術(shù)組(P<0.01)，而電針組穿越平臺次數(shù)則多于模型組(P<0.05)。見表1。

組別n逃避潛伏期(s)穿越平臺次數(shù)(次)第1天第2天第3天第4天第5天假手術(shù)組2053.7±12.248.4±11.426.4±10.4▲▲17.3±8.4▲▲16.3±4.3▲▲4.7±1.0▲▲模型組2057.6±10.451.2±8.049.4±9.344.2±8.733.6±7.80.7±0.2電針組2056.4±9.249.3±9.831.6±6.9▲▲25.1±7.1▲▲24.6±6.4▲▲2.8±0.6▲

注：與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

2.2 Western blot法檢測海馬CA1區(qū)caspase-3的表達(dá)量比較

模型組的caspase-3蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，且比電針組表達(dá)明顯。見圖1。

注:A.假手術(shù)組；B.模型組；C.電針組。圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)caspase-3蛋白的表達(dá)水平

2.3 各組海馬病理學(xué)檢查結(jié)果比較

假手術(shù)組觀察到海馬CA1區(qū)無細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)改變，神經(jīng)元形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，核橢圓藍(lán)染，胞質(zhì)粉紅;模型組海馬CA1區(qū)組織間質(zhì)水腫，神經(jīng)元細(xì)胞排列松散，神經(jīng)細(xì)胞萎縮，核固縮嚴(yán)重，空泡較多；電針組腦組織恢復(fù)程度明顯，水腫幾乎消失，細(xì)胞層次清晰，損傷組織周圍可見完好細(xì)胞結(jié)構(gòu)，核固縮現(xiàn)象減少,空泡減少。見封三彩圖2。

3 討論

創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)常常發(fā)生突然，預(yù)后不佳。海馬結(jié)構(gòu)屬于腦的邊緣系統(tǒng)中的重要結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知功能有關(guān)[6]。海馬組織尤其是CA1區(qū)對缺氧等損傷最為敏感，也被稱為易損區(qū)[7]。TBI發(fā)生后其神經(jīng)破壞和神經(jīng)功能恢復(fù)的過程可概括為:①原發(fā)性損傷對腦組織的破壞；②TBI后損傷部位及其周圍的神經(jīng)細(xì)胞繼續(xù)發(fā)生壞死或凋亡，繼而產(chǎn)生繼發(fā)腦損傷(Secondary brain injury,SBI);③TBI后神經(jīng)元的自我修復(fù)與再生[8]。細(xì)胞凋亡是重要的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式，是一系列高度調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶(caspase)級聯(lián)反應(yīng)事件的結(jié)果[9]。在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，caspase-3位于該反應(yīng)的下游，與其他下游的caspase成員一起執(zhí)行凋亡事件[10-11]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察caspase-3在腦損傷大鼠海馬CA1區(qū)表達(dá)量的變化以及細(xì)胞病理學(xué)改變，揭示電針對顱腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制，即通過下調(diào)caspase-3的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)與再生。

顱腦損傷在中醫(yī)里屬“腦傷”“跌仆”，病位在腦，病機(jī)為血瘀、氣滯導(dǎo)致清竅閉阻或氣機(jī)逆亂，《諸病源候論》說：“夫有瘀血者，令人喜忘”，故治療應(yīng)活血化瘀、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)理氣機(jī)[12]。本研究穴選督脈加手足陽明經(jīng)穴，《難經(jīng)》曰:“督脈者，起于下極之俞，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”，且督脈與手足三陽經(jīng)及陽維脈交會，總督一身陽氣，統(tǒng)帥整體經(jīng)脈[13]。百會穴屬督脈通于腦，醒神益智、升清降濁。大椎穴能調(diào)節(jié)臟腑功能，健腦益髓。顱腦外傷后對學(xué)習(xí)記憶能力有所影響，《黃帝明堂經(jīng)》中就有內(nèi)關(guān)主“失智”，能“醒腦神”的記載[14]。足三里為陽明經(jīng)穴，補(bǔ)益氣血，為治療下肢痿痹的要穴。電針上述穴位，給予顱腦損傷大鼠連續(xù)電生理刺激，以養(yǎng)血祛瘀、醒神健腦。

本研究從顱腦損傷后電針對大鼠的認(rèn)知功能和海馬CA1區(qū)凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)量的影響，探索了電針對于腦損傷治療的作用機(jī)制，即通過抑制凋亡蛋白caspase-3 的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡線粒體途徑的級聯(lián)反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡，從而恢復(fù)認(rèn)知功能。