單葉蔓荊子提取物的抑菌活性

沈恬安，楊德友，駱焱平，王蘭英

(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，海口 570228)

蔓荊子(VitextrifoliaLinn.)屬馬鞭草科(Verbenaceae)牡荊屬(VitexLinn.)[1]，最初收錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，廣泛分布于我國(guó)的沿海沙灘地[2]，其化學(xué)活性組分包括萜類[3]、茨烯[4]、脂肪酸[5]、氨基酸[6]、黃酮酚類[7]和微量元素[8]等。關(guān)于蔓荊子的研究主要集中在醫(yī)用活性方面，據(jù)報(bào)道蔓荊子有治療頭痛[9]、免疫性炎癥[10]、降壓[11]、防癌和腫瘤[12]、祛痰平喘[13]、抗衰老[14]、抗病毒[15]等功效。此外，也有研究指出蔓荊子是我國(guó)南方固沙的先鋒植物，不僅可固沙改土，還可改良土壤，甚至改善環(huán)境條件。關(guān)于其農(nóng)用方面的研究相對(duì)較少。筆者以單葉蔓荊子為研究對(duì)象，對(duì)其種子和葉進(jìn)行粗提，并測(cè)定粗提物的抑菌活性，旨在明確蔓荊子在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物樣品與菌種 單葉蔓荊子采自海南省?？谑胁h棋子灣，采回后將葉與種子分開，置于陰涼處晾干，在干燥箱中40～60 ℃烘干3 d，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后稱重并密封，置于0～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。主要供試菌種：水稻稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)、橡膠炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz.Sace)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumomysporum(Schl) f.spcucumerinum)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、蘋果輪紋病菌(Botryosphaeriadothidea)和芒果蒂腐病菌(Botryodiplodiatheobromae)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense, Foc)、芒果炭疽病菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)、火龍果黑斑病菌(Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae(Berk&Curt)Arx)、葡萄潰瘍病菌(Botryosphaeriadothidea)和番木瓜炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)，均由海南大學(xué)農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)對(duì)照藥劑：殺菌劑苦參堿(水劑，有效成分≥0.3%)

1.2 單葉蔓荊子粗提物制備 采用冷浸法[16]制備單葉蔓荊子粗提物：取植物樣品種子和葉子，置于烘箱內(nèi)烘干3 d，粉碎后稱重。取上述種子和葉子粉末，加入適量丙酮(以浸過植物材料為宜)在25 ℃條件下浸漬提取72 h，抽濾3次，合并濾液減壓濃縮，得到單葉蔓荊子種子和葉部的丙酮浸膏。

1.3 培養(yǎng)平板的制作 分別稱取單葉蔓荊子種子和葉部浸提膏1.4 g，加入2 mL丙酮，用無(wú)菌水定容至7 mL，配制成200 g·L-1母液，備用；將19 mL PDA培養(yǎng)基裝于50 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷卻后加入1 mL單葉蔓荊子提取物，混勻，分別倒入3個(gè)6 cm培養(yǎng)皿中，制成最終濃度為10 g·L-1的含毒培養(yǎng)平板。以含有相同濃度的丙酮做陽(yáng)性對(duì)照，以含有0.01 g·L-1的苦參堿為陰性對(duì)照。

1.4 單葉蔓荊子粗提物抑菌活性測(cè)定 分別將供試靶標(biāo)真菌接種于PDA培養(yǎng)基上適溫培養(yǎng)3 d，用直徑為5mm的打孔器打取菌餅，接種于上述培養(yǎng)平板中央。適溫培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按照下列公式計(jì)算抑菌率。

1.5 單葉蔓荊子種子粗提物毒力方程建立 按照1.3中方法將單葉蔓荊子種子粗提物配制成質(zhì)量濃度為400，200，100，50，25 g·L-1，分別移取1 mL加入至19 mL 滅菌的PDA中，搖勻后迅速分裝于3個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后分別接入直徑為5 cm的小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌菌種。25 ℃培養(yǎng)72 h，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按照1.4中公式計(jì)算抑菌率，建立毒力回歸方程，求EC50。

2 結(jié)果與分析

3.1 單葉蔓荊子葉部粗提物抑菌活性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定單葉蔓荊子葉部粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌等6種植物病原真菌的抑菌活性，結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)：該粗提物對(duì)不同靶標(biāo)菌抑菌活性不同，其中對(duì)小麥赤霉病菌抑菌效果最好，培養(yǎng)后期抑菌率可達(dá)50%；對(duì)橡膠炭疽病菌活性最差，培養(yǎng)后期對(duì)該靶標(biāo)菌起到促進(jìn)生長(zhǎng)作用?？傮w來(lái)看，單葉蔓荊子葉部粗提物對(duì)供試靶標(biāo)菌抑菌活性均低于陽(yáng)性對(duì)照(苦參堿)。

表1 單葉蔓荊子葉部粗提物抑菌活性測(cè)定

注：DW：水稻稻瘟病菌，XT：橡膠炭疽病菌，HK：黃瓜枯萎病菌，XC：小麥赤霉病菌，PL：蘋果輪紋病菌，MD：芒果蒂腐病菌；“*”表示促進(jìn)效果。

Note: DW:Magnaportheoryzae；XT:ColletotrichumgloeosporioidesPenz.Sace；HK:Fusariumomysporum(Schl) f.spcucumerinum). XC；Fusariumgraminearum；PL:Botryosphaeriadothidea；MD:Botryodiplodiatheobromae. “*” indicates a promoting effect

3.2 單葉蔓荊子種子粗提物抑菌活性測(cè)定 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定單葉蔓荊子種子粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌等12種植物病原真菌的抑菌活性(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該粗提物對(duì)供試的8種靶標(biāo)菌均有不同程度的抑菌活性，尤其對(duì)小麥赤霉病菌和蘋果輪紋病菌持效性好，測(cè)試時(shí)間內(nèi)對(duì)小麥赤霉病菌抑菌率可達(dá)70%，對(duì)蘋果輪紋病菌抑菌率達(dá)60%以上；此外，該粗提物對(duì)水稻稻瘟病菌培養(yǎng)24 h抑菌率可達(dá)83.56%，后期雖然抑菌效果有所下降，但抑菌率仍在60%左右；該粗提物對(duì)橡膠炭疽病菌、芒果炭疽病菌、火龍果黑斑病菌及番木瓜炭疽病菌均表現(xiàn)出促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的作用。所獲得的數(shù)據(jù)整體來(lái)看，單葉蔓荊子種子粗提物普遍低于陽(yáng)性對(duì)照(苦參堿)。

表2 單葉蔓荊子種子粗提物抑菌活性測(cè)定

注：DW：水稻稻瘟病菌，XT1：橡膠炭疽病菌，HK：黃瓜枯萎病菌，XC：小麥赤霉病菌，PL：蘋果輪紋病菌，MD：芒果蒂腐病菌，XK：香蕉枯萎病菌，MT：芒果炭疽病菌，HH：火龍果黑斑病菌，XT2：香蕉炭疽病菌，PK：葡萄潰瘍病菌，F(xiàn)T：番木瓜炭疽病菌；“*”表示促進(jìn)效果

Note: DW:Magnaportheoryzae； XT1:ColletotrichumgloeosporioidesPenz；Sace. HK:Fusariumomysporum(Schl)f.spcucumerinum； XC:Fusariumgraminearum； PL:Botryosphaeriadothidea； MD:Botryodiplodiatheobromae； XK:Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc； MT:ColletotrichumgloeosporioidesPenz； HH:Bipolariscactivora(Petrak) Alcorn； XT2:Colletotrichummusae(Berk&Curt)Arx； PK:Botryosphaeriadothidea； FT:Colletotrichumgloeosporioides. “*” indicates a promoting effect

3.3 單葉蔓荊子種子粗提物毒力方程的建立 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定單葉蔓荊子種子粗提物對(duì)小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌的毒力(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，針對(duì)2種靶標(biāo)菌單葉蔓荊子種子粗提物毒力方程R2均在0.9之上，說明方程相關(guān)性好，可信度高。根據(jù)相應(yīng)毒力方程計(jì)算對(duì)小麥赤霉病菌、蘋果輪紋病菌抑制中濃度分別為112.53，142.49 g·L-1。

表3 TTY及中間體抑菌活性測(cè)定

4 討 論

小麥赤霉病是小麥在全世界普遍發(fā)生的主要病害之一，已成為影響小麥高質(zhì)量、高產(chǎn)量的重大隱患，若防治不當(dāng)會(huì)造成小麥減產(chǎn)乃至絕收等情況[17]；蘋果輪紋病又稱粗皮病、輪紋爛果病，是蘋果主要病害之一，主要危害部位在樹干和果實(shí)，植株得病后，其樹勢(shì)、果實(shí)會(huì)嚴(yán)重的削弱和腐爛，后果不容忽視[18]。生物防治植物病害因具備對(duì)生態(tài)環(huán)境影響小，低殘留、無(wú)污染的等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越受到人們重視。本研究發(fā)現(xiàn)單葉蔓荊子葉子粗提物對(duì)供試靶標(biāo)菌影響力不同，尤其對(duì)小麥赤霉病菌和蘋果輪紋病菌抑菌活性高、持效性長(zhǎng)，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的潛在價(jià)值。因此，在今后研究中有必要對(duì)其開展應(yīng)用研究，為生物防治植物病害奠定基礎(chǔ)。另外，由于本研究?jī)H用丙酮對(duì)供試的單葉蔓荊子的種子和葉進(jìn)行提取，未嘗試其他提取溶劑，因此鑒于該植物種子的優(yōu)良性狀，有必要采用不同極性的溶劑對(duì)其活性成分展開更為系統(tǒng)的提取研究。