多梳基因蛋白EZH2促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌血管生成的機(jī)制及臨床評價(jià)

蘇 娟 吉曉濱 李 鵬 李 雯 謝景華

1 廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(廣州 510180) 2 廣州市第一人民醫(yī)院病理科(廣州 510180)

喉鱗狀細(xì)胞癌(1 aryngal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部腫瘤比較常見的一種惡性腫瘤，LSCC的發(fā)病率、死亡率一直逐年增加，嚴(yán)重影響人類的生存質(zhì)量。癌有血管依賴性，癌組織中豐富的新生血管為腫瘤的生長提供充足的營養(yǎng)成分、氧氣及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移途徑[1]。腫瘤微血管密度(microvessel density，MVD)是目前公認(rèn)的評估腫瘤血管生成形態(tài)學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)[2]。血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子31(platelet endothelial cell adhesion molecule-31，CD31)是廣泛應(yīng)用的新生血管生成標(biāo)記物，其標(biāo)記的微血管密度(CD31-MVD)可用于評估腫瘤血管新生，與腫瘤形成、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)[3]。

果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)屬于多梳基因蛋白，可促進(jìn)腫瘤血管生成，在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[4- 6]，是目前腫瘤生物治療研究的新熱點(diǎn)。但迄今關(guān)于EZH2在LSCC中表達(dá)的研究并不多見，EZH2、CD31與LSCC臨床及預(yù)后的關(guān)系研究也很少，我們對此作了測定和探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2012年1月—2013年8月就診于廣州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，并住院行部分喉或全喉切除術(shù)的61例LSCC患者的石蠟組織標(biāo)本。臨床資料齊全，病理明確為LSCC，分化程度明確。術(shù)前均未經(jīng)化療、放療或其他治療。其中男56例，女5例，年齡35～79(60.9±10.8)歲。所有患者均接受術(shù)后常規(guī)隨訪，主要通過電話、門診復(fù)查等形式，隨訪時(shí)間≥5年，自確診之日開始，最晚至2018年10月結(jié)束。同期正常對照組20例，其中男18例，女3例，年齡在39～75(58.1±8.9)歲。標(biāo)本來源于接受全喉手術(shù)的患者，標(biāo)本距腫瘤邊緣≥2 cm，病理證實(shí)無癌組織。標(biāo)本由兩位病理醫(yī)生雙盲法復(fù)查。

1.2 試劑

CD31單克隆抗體、通用型SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒購自美國SantaCruz生物工程有限公司；兔抗人EZH2單克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司，二抗購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，厚度約4 μm。脫蠟、水化后以3%H2O2室溫孵育10min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，熱修復(fù)抗原5min。滴加一抗(EZH2為1:50；CD31為1:100)4 ℃孵育過夜。次日加入二抗37 ℃孵育2 h，DAB室溫下顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片。用試劑公司提供的大腸癌組織切片作CD31染色的陽性對照，EZH2以已知陽性乳腺癌組織切片做陽性對照。以PBS緩沖液代替一抗做陰性對照。

1.4 結(jié)果判定

CD31-MVD計(jì)數(shù)：凡被抗體染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞簇作為1個(gè)微血管計(jì)數(shù)，按Weidner[7]法進(jìn)行，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡下微血管數(shù)，取平均值作為MVD值。EZH2陽性呈棕黃色染色，主要位于細(xì)胞核/胞漿。根據(jù)染色強(qiáng)度和細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行分級。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡(×400)下視野取平均值。染色強(qiáng)度：無著色、淡黃色、黃或深黃色、褐或棕褐色分別評為0、1、2、3分；細(xì)胞數(shù)目：無陽性細(xì)胞、陽性細(xì)胞<25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別評為：0、1、2、3、4分。兩評分相加：0分為(-)；1～2分為(+)；3～4 分為(++)；5～6分為(+++)，≥3分則為強(qiáng)陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman秩相關(guān)分析。Kaplan-Meier生存分析、Log-rank檢驗(yàn)和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CD31的表達(dá)

2.1.1 CD31在LSCC和NLT中的表達(dá)對比 CD31的陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要集中在腫瘤組織邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞,微血管或呈條索狀、或具有管腔，形態(tài)不規(guī)則，分布不均。而在NLT中微血管形態(tài)規(guī)則，分布少、較均勻(圖1)。61例LSCC中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.26±2.46，20例NLT中為1.20±1.10，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-15.85，P<0.05)。

A CD31在T3期LSCC中的陽性表達(dá)；B CD31在T4期LSCC中的陽性表達(dá)；C CD31在NLT中的陰性表達(dá)；D CD31在NLT中的弱陽性表達(dá)圖1 CD31在LSCC和NLT中的表達(dá)(SP×400)

2.1.2 CD31-MVD與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CD31-MVD與LSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、T分級和臨床分期有關(guān)(P均<0.05，見表1)。

表1 LSCC中CD31-MVD、EZH2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

*為連續(xù)性校正檢驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

臨床病理因素nCD31-MVD(/0.5mm2)MVD(x±s)t/FPEZH2-+陽性率/%χ2P組織學(xué)分級 高分化339.55±2.090.8210.4462760.705.500.04 中分化229.86±1.9612165.20 低分化610.67±1.751572.89淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N0349.32±2.46-3.770.0072759.395.130.04? N+2711.56±2.0812673.38T分級 T178.71±1.804.110.103431.759.200.03 T2139.15±2.1921166.15 T31410.71±2.2321266.71 T42711.19±2.2022571.15臨床分期 Ⅰ78.71±1.804.320.013442.239.600.02 Ⅱ129.17±2.2921065.52 Ⅲ1310.31±1.9721166.15 Ⅳ2911.28±2.2522771.39吸煙指數(shù)(每天吸煙支數(shù)×吸煙年限) <400289.79±2.36-1.450.1552362.970.380.53? ≥4003310.64±2.2242968.22

*為連續(xù)性校正檢驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 CD31-MVD對LSCC的術(shù)后預(yù)后評估 27例術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者組的CD31-MVD(/0.5 mm2)為10.19±2.11，高于34例術(shù)后5年未復(fù)發(fā)患者組(8.71±1.43，t=3.26，P<0.05)。

2.2 EZH2的表達(dá)

2.2.1 EZH2在LSCC和NLT中的表達(dá)對比 EZH2蛋白定位于細(xì)胞核，陽性染色深淺不一，表現(xiàn)為棕黃色或棕褐色顆粒狀，可呈灶狀或彌漫分布。LSCC中的染色深，以強(qiáng)陽性為主，NLT中陽性著色淺，以弱陽性為主(圖2)。EZH2蛋白表達(dá)的陽性率在LSCC為65.57%(40/61)，大于NLT 30.0%(6/20)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.92，P<0.05)。

A EZH2在LSCC中呈中度陽性表達(dá)；B EZH2在LSCC中呈強(qiáng)陽性表達(dá)；C EZH2在NLT中呈陰性表達(dá)；D EZH2在NLT中呈弱陽性表達(dá)圖2 EZH2在LSCC和NLT中的表達(dá)(SP×400)

2.2.2 EZH2與LSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 EZH2陽性表達(dá)與組織學(xué)分級、T分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05，表1)。

2.2.3 EZH2對LSCC的術(shù)后預(yù)后評估 27例術(shù)后5年復(fù)發(fā)患者組的EZH2陽性率為74.07%(20/27)，高于34例術(shù)后5年未復(fù)發(fā)患者組的EZH2的陽性率(52.94%，18/34，χ2=3.89，P<0.05)。

2.3 CD31-MVD與EZH2的相關(guān)性分析

LSCC中EZH2表達(dá)陽性者的MVD值(/0.5 mm2)為10.62±2.03、陰性者為7.37±2.55，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.53，P<0.05)。CD31-MVD和EZH2呈正相關(guān)(r=0.67，P<0.05，圖3)。

圖3 EZH2與CD31-MVD相關(guān)性分析

2.4 CD31-MVD、EZH2與生存的關(guān)系

2.4.1 生存情況 61例LSCC失訪3例，隨訪率95.08%。3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。

2.4.2 生存分析顯示，CD31-MVD逐漸增大，則LSCC總生存率隨之下降。在CD31-MVD各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.03，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中CD31-MVD值(/0.5 mm2)為10.91±2.13，43例>5年生存組為8.76±2.52，表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.36，P<0.05)。

2.4.3 生存分析顯示，EZH2染色級別增高，則LSCC總生存率隨之下降，在EZH2表達(dá)(-)-(+++)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.69，P<0.05)。61例LSCC患者中，18例≤5年生存組中與43例>5年生存組相比較，EZH2表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.60，P<0.05)。

2.5 LSCC預(yù)后的單因素分析

組織學(xué)分級、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、吸煙指數(shù)、有無復(fù)發(fā)對預(yù)后的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表2)。

2.6 多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析

以隨訪5年生存狀態(tài)為結(jié)局變量，1=死亡，0=截尾(生存或失訪)，以表2中有統(tǒng)計(jì)意義的因素加上CD31-MVD、EZH2建立回歸模型。在Cox Regression中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、有無復(fù)發(fā)是預(yù)后獨(dú)立影響因素(見表3)。

2.7 生存模型和預(yù)后指數(shù)

根據(jù)表3結(jié)果，建立LSCC患者的生存模型如下：h(t，x)=h0(t)exp(1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5)，預(yù)后指數(shù)PI=1.302 X1+1.531 X2+1.509 X3+2.891 X4+2.678 X5(X1：EZH2；X2：CD31-MVD；X3：是否復(fù)發(fā)；X4：臨床分期；X5：有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)。說明：PI值大，則生存的可能性低、預(yù)后差；PI值小則相反。

表2 LSCC患者預(yù)后影響因素的單因素分析結(jié)果 [例(%)]

表3 LSCC患者的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果

3 討 論

喉鱗狀細(xì)胞癌作為一種常見的頭頸部腫瘤，其病因一直不明確，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，惡性腫瘤血管生成促進(jìn)其增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。MVD是反映血管生成的重要指標(biāo)，對衡量腫瘤血管生成及預(yù)后具有重要意義[8]。CD31是免疫球蛋白超家族成員，作為血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，CD31在成熟與未成熟的腫瘤血管中均有表達(dá)，并調(diào)節(jié)腫瘤血管生成。目前臨床上廣泛應(yīng)用CD31對血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可精確地反映MVD[9]。我們的研究表明：①CD31-MVD值在LSCC組織中的表達(dá)(10.26±2.46)明顯高于NLT(1.20±1.10)。CD31在LSCC中表達(dá)明顯，主要集中于腫瘤組織邊緣區(qū)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，而在NLT中表達(dá)較弱，說明CD31可提示惡性腫瘤中新生微血管的旺盛程度；②CD31-MVD值與LSCC的T分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復(fù)發(fā)有關(guān)；③生存分析顯示CD31可用于預(yù)后的判斷，CD31-MVD值越大，則生存期越短。

血管生成基因?qū)τ谘芯磕[瘤血管生成機(jī)制、探尋生物治療靶點(diǎn)意義非常。EZH2是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種血管生成基因，是多梳基因家族(polycomb group genes， PcGs)的核心成員。腫瘤血管生成機(jī)制主要在于血管生成促進(jìn)因子(如血管內(nèi)皮生成因子、纖維母細(xì)胞生長因子)和血管生成抑制因子(如血管抑素、內(nèi)皮抑素)之間的相互調(diào)節(jié)，血管內(nèi)皮細(xì)胞為調(diào)節(jié)因子作用的靶細(xì)胞，血管生成促進(jìn)因子濃度升高或抑制因子濃度下降都可促進(jìn)腫瘤血管生成，造成腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移[10]。而 EZH2主要通過 VEGF-E2、F-EZH2-VASH1[11]和 FGF-2-NDY1/EZH2-miR-101-EZH2[12]機(jī)制參與了這一調(diào)節(jié)過程。

許多研究證實(shí)，相對于正常組織，EZH2高表達(dá)于多種癌組織，如前列腺癌[13]、乳腺癌[14]、膀胱移行細(xì)胞癌[15]、胃癌[16]、肺癌[17]、口腔癌[18]、白血病[19]等，且在它們的病程發(fā)生發(fā)展、預(yù)后中起重要作用。然而，EZH2在LSCC發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)作用研究在國內(nèi)外還極為少見。本研究中LSCC組EZH2呈高表達(dá)，與組織學(xué)分級、T分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。相關(guān)性分析顯示LSCC中EZH2陽性組CD31-MVD值明顯高于陰性組、CD31-MVD計(jì)數(shù)與EZH2呈正相關(guān)，表明EZH2與LSCC血管生成有關(guān)。生存分析顯示LSCC中EZH2蛋白高表達(dá)預(yù)示著患者生存期短、預(yù)后較差。

全組61例LSCC總3年生存率83.71%，5年生存率70.49%。生存分析顯示，CD31-MVD值增加，LSCC總生存率則隨之下降，CD31-MVD計(jì)數(shù)各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CD31-MVD高，預(yù)示患者生存期短。61例LSCC患者>5年、≤5年兩組之間EZH2蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EZH2蛋白表達(dá)高，則患者生存期短。在Cox多因素分析中，CD31-MVD、EZH2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、有無復(fù)發(fā)是預(yù)后獨(dú)立影響因素，EZH2、CD31表達(dá)高，提示LSCC預(yù)后差。

綜上所述，EZH2蛋白在LSCC中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)LSCC新生血管生成、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后。這與EZH2可促進(jìn)血管生成的機(jī)制及癌組織侵襲轉(zhuǎn)移相一致[20]。進(jìn)一步研究、開發(fā)EZH2分子抑制劑可為LSCC的治療提供新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)，為LSCC患者帶來了新的福音。