MMP-9蛋白的抗原表位分析及單克隆抗體制備

許映雪 尹煥才

（1. 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，蘇州 215163；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

細胞外基質(zhì)對于維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要，它們通常分布在細胞表面或細胞之間，是由細胞合成并分泌到胞外的大分子，主要是一些多糖和蛋白，或蛋白多糖。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，支持并連接組織結(jié)構(gòu)，參與細胞的各種生理活動。在炎癥、腫瘤等病理情況下，正常的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，進一步加劇炎性細胞浸潤、腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移等病理進程，這些病理進程通常與基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）息息相關(guān)［1］。

迄今為止，在人體中已發(fā)現(xiàn)超過20種MMPs。MMPs作為一類Zn2+依賴性內(nèi)切酶家族，是分解細胞外基質(zhì)的蛋白酶類中最重要的一類。根據(jù)其降解底物的不同，可將人源性MMPs分為膠原酶類（MMP-1、-8、-13和 -18）、明膠酶類（MMP-2和 -9）、間質(zhì)溶解素（MMP-3、-10和 -11）、膜型MMPs（MMP-14、-15、-16、-17、-24 和 -25）及其他MMPs五大類［2］。正常生理條件下，MMPs活性很低并受到轉(zhuǎn)錄水平上的嚴格調(diào)控，同時受到金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）的調(diào)節(jié)，其以酶原的形式被分泌到細胞外基質(zhì)中，被激活后特異性作用于細胞外基質(zhì)［3］。而在某些疾病病程中MMPs活性卻顯著增強，如動脈粥樣硬化、腎炎、纖維素炎等［4］。

MMP-9，又稱明膠酶B，是MMPs家族中相對分子質(zhì)量最大的酶，其基因定位于20q11.2-13.1［5］，可由單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、成纖維細胞及多種腫瘤細胞分泌［6］，其表達受到多種正常細胞及腫瘤細胞分泌的多種細胞因子及生長因子的調(diào)控，如白介素［7-9］、干擾素［10］、EGF［11］、NGF［12］、FGF［13］、VEGF［14］、PDGF［15］、TGF-β［16-18］等，其活化形式的作用底物也十分廣泛，包含明膠、部分類型的膠原蛋白，彈性蛋白以及層粘連蛋白等。MMP-9的主要結(jié)構(gòu)包括MMPs家族共有的氨基端前肽區(qū)、羧基端類血紅蛋白結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的含有Zn2+結(jié)合位點的催化區(qū)，其催化區(qū)還有一個能與明膠及纖維蛋白高度親和的嵌入式區(qū)域［19］。正常生理條件下，MMP-9與其他MMPs協(xié)同作用，共同參與正常組織的發(fā)育及重塑，如胚胎發(fā)育、血管生成、骨骼塑型、傷口愈合等，另一方面也通過破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基膜屏障，促進腫瘤新生血管的形成和腫瘤生長，利于腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等病理過程［20-21］。

目前，市場上已有的MMP-9抗體產(chǎn)品中，國外單克隆抗體占據(jù)主要市場，但因其價格較為昂貴，臨床大批量使用成本較高。國內(nèi)的MMP-9抗體以多克隆抗體為主，且只用于科研使用，尚未出現(xiàn)臨床產(chǎn)品。本研究旨在初步開發(fā)MMP-9單抗臨床試劑盒，為MMP-9的腫瘤臨床篩查應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源cDNA為本實驗室保存，TOP10和BL21（DE3）為本實驗室保存。Taq DNA聚合酶及其相應(yīng)的PCR反應(yīng)用試劑購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI、T4 DNA連接酶及其相關(guān)試劑購自 Fermentas公司；1.5 kb DNA ladder marker、PCR產(chǎn)物純化和DNA片段膠回收試劑盒購自Axygen公司；TIANprep快速質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）購自北京天根生物技術(shù)公司；HRP交聯(lián)的兔抗鼠二抗購自Rockland公司；化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑購自Millipore公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum）、胰酶Trypsin-EDTA購自GIBCO公司；HAT培養(yǎng)基購自Sigma公司；基因合成測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 MMP-9蛋白的抗原表位預(yù)測及引物設(shè)計 通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因全長序列，利用DNAstar-Protean、PBD對其跨膜區(qū)、親水性等性質(zhì)進行分析，篩選其抗原表位區(qū)，命名為Δmmp9。通過分析抗原表位區(qū)序列，釣取最終目的基因的片段，設(shè)計引物序列，并在5′端和3′端分別引入BamH I和XhoI的酶切位點。

1.2.2 重組表達載體pET28α（+）-Δmmp9構(gòu)建 以人源cDNA為模板，以人工合成引物擴增目的片段，引物序列為Primer1：5′-CGGGATCCATGCAGGACGG CAATGCTGAT -3′（下劃線序列為BamH I酶切位點），Primer2 ：5′-CGCTCGAGCGCCACGAGGAACAAACT-3′（下劃線序列為XhoI酶切位點）。PCR擴增反應(yīng)條件 ：94℃ 5 min ；94℃ 1 min，56℃ 30 s，72℃ 45s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物與原核表達載體pET28α（+）質(zhì)粒用BamHI和XhoI進行雙酶切，將兩者的雙酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到TOP10，篩選陽性克隆，提取重組表達載體pET28α（+）-Δmmp9后送往上海生工測序。

1.2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達 將分析結(jié)果正確的重組載體 pET28α（+）-Δmmp9 轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3），選用終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，誘導(dǎo)4 h，陰性對照組不加IPTG誘導(dǎo)劑。5 000 r/min 10 min，棄上清，收集菌體沉淀，并用PBS溶液重懸，冰浴超聲，參數(shù)為time 20 min，pluse 5 s，超聲5 s，功率39%。超聲后4℃，16 000 r/min 1 h，分別收集并標(biāo)記上清液及沉淀。用包涵體溶解液溶解沉淀，分別取上清液和包涵體溶解液的樣品進行SDSPAGE電泳驗證，分析結(jié)果。

1.2.4 重組蛋白擴增培養(yǎng)及純化 將上步含有重組載體 pET28α（+）-Δmmp9的 BL21（DE3）菌液及時擴增培養(yǎng)，按照同樣誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達，離心收集菌體沉淀，重懸后冰浴超聲破碎，離心取沉淀，溶解后離心取上清液，此上清液即為溶解的重組蛋白。過0.22 μm膜后用Ni柱純化，將洗脫液咪唑濃度按照 100 μmol/L → 300 μmol/L → 500 μmol/L 梯度調(diào)節(jié)，保留流穿樣品及純化樣品進行SDS-PAGE電泳驗證。按照電泳結(jié)果將含目的蛋白的洗脫液進行透析復(fù)性、超濾濃縮，過濾除菌后-80℃保存。

1.2.5 重組蛋白免疫小鼠 將純化后的重組蛋白作為抗原與弗氏完全佐劑1∶1混合，對5只7-10周齡的BALB/c小鼠按照常規(guī)免疫程序進行首免，首免抗原濃度為1 mg/mL，免疫劑量為0.1 mL/只。二免-四免抗原與弗氏不完全佐劑混合，抗原濃度為0.5mg/mL，免疫劑量為0.1 mL/只，首免后第21 d進行二免，二免到三免，三免到四免間隔時間為14 d。四免后第7 d小鼠眼眶采血，10 000 r/min 10 min，取上清做抗體檢測時的陽性對照，陰性對照取免疫前小鼠血清。

1.2.6 單克隆雜交瘤細胞株的建立及篩選 已經(jīng)免疫的BALB/c小鼠無菌條件下摘取脾臟，制成脾細胞懸液，與骨髓瘤細胞SP2/0按5∶1比例混合，采用PEG1500作為融合劑，按照常規(guī)融合方法。待細胞集落長至孔底1/2時吸出所有克隆生長孔的上清用間接ELISA法進行抗體檢測，挑取特異性好的陽性孔及時凍存和克隆化，篩選出單克隆細胞株。

1.2.7 腹水制備、純化及效價檢測 取3-6只BALB/c小鼠提前7 d腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5mL/只，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整待接種的雜交瘤細胞密度至8×105個/mL，腹腔注射，1 mL/只。密切觀察小鼠的腹水征象，每隔1-3 d取一次腹水。用親和層析柱純化腹水，收集純化的單抗，用間接ELISA法進行抗體效價測定。

1.2.8 配對單抗的篩選 采用雙抗夾心ELISA法篩選配對抗體。從得到的單抗中取出兩種單抗，一種作為捕獲抗體，一種作為標(biāo)記抗體（經(jīng)過HRP酶標(biāo)記），將捕獲抗體包被抗原板，加入稀釋的重組蛋白作為抗原，再加標(biāo)記抗體，最后加入顯色液顯色。根據(jù)配對實驗結(jié)果調(diào)整后續(xù)配對實驗，最終篩選出合適的配對抗體并確定其有效工作濃度。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9蛋白的抗原表位預(yù)測

通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因信息，其數(shù)據(jù)顯示該蛋白經(jīng)成熟化后，包含的氨基酸序列為第94-707位，為了避免產(chǎn)生針對信號肽和前導(dǎo)肽的抗體副產(chǎn)物而影響最終抗體的總效價，重組蛋白抗原的最終片段必須包括第94-707位氨基酸中。通過DNAstar-Protean軟件分析重組蛋白的氨基酸序列分布情況，預(yù)測結(jié)果（圖1-A）表明：該蛋白主要以親水性氨基酸為主，α螺旋結(jié)構(gòu)較少，該蛋白整體親水性較強，選取該蛋白中親水性較強又具有較小空間位阻的氨基酸序列區(qū)段，通過該蛋白現(xiàn)有的不完全晶體結(jié)構(gòu)利用PBD等數(shù)據(jù)庫同源建模得到MMP-9蛋白的空間立體結(jié)構(gòu)圖（圖1-B）表明：該蛋白具有一個較長的信號肽末端，同時含有4個明顯的二級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)之間有幾條完全暴露在外的強親水性的氨基酸序列。基于以上信息，選取包含暴露在二級結(jié)構(gòu)外的、具有較強親水性的多肽序列，即包括第288-389位氨基酸的多肽序列（圖1-C），即選取包含第278-399位氨基酸多肽作為最終基因釣取片段，命名為Δmmp9。

2.2 重組表達載體pET28α（+）-Δmmp9構(gòu)建

以人源cDNA為模板，以人工合成的引物擴增目的基因片段，結(jié)果（圖2-A）顯示該片段大小為581 bp，質(zhì)粒pET28α（+）大小為5 369 bp，重組表達載體pET28α（+）-Δmmp9轉(zhuǎn)化抽提后，使用BamH I和XhoI進行雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖2-B）顯示有2條DNA條帶，分別獲得581 bp的目的基因和5 369 bp的載體片段。將基因測序的結(jié)果與NCBI中MMP-9序列對比，無堿基突變，表明目的基因片段已正確插入pET28α（+）載體中。

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達

重組表達載體 pET28α（+）-Δmmp9轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），以終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃，220 r/min，誘導(dǎo)表達4 h。離心取菌體沉淀冰浴超聲破碎，高速離心分離上清液和包涵體，對其進行SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3）顯示包涵體樣品中在15 kD左右有一條清晰明顯的深色條帶，其蛋白大小與預(yù)期重組蛋白大小一致，證明該蛋白即為重組蛋白Δmmp9，且在BL21的包涵體中表達成功。

圖1 抗原表位區(qū)預(yù)測

圖2 重組表達載體pET28α（+）-Δmmp9鑒定

2.4 重組蛋白擴增培養(yǎng)及純化

將含有重組載體pET28α（+）-Δmmp9的BL21（DE3）菌液擴增培養(yǎng)，按照同樣誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達，離心收集菌體沉淀，重懸后冰浴超聲破碎，離心取沉淀，溶解后離心取上清液，過0.22 μm膜后用Ni柱純化，保留流穿樣品、純化樣品進行SDS-PAGE電泳驗證，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)在流穿樣品中含有很少的重組蛋白，300 μmol/L咪唑洗滌液洗脫重組蛋白效果最好，可見15 kD處有明顯條帶，純化成功。

2.5 單克隆雜抗體交瘤細胞株建立

取免疫后小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞，通過PEG1500融合獲得雜交瘤細胞，經(jīng)過HAT培養(yǎng)基初步篩選培養(yǎng)，對陽性孔采取有限稀釋法挑選單克隆抗體雜交瘤細胞株，最終獲得7株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為C3B3B11、D10D8、B4-4、D6G7、5-9、B8C5G10 及 A6A10。

2.6 腹水制備及效價檢測

BALB/c小鼠依次標(biāo)記并接種7株雜交瘤細胞株后，收集腹水，經(jīng)過親和柱層析法對抗體進行純化，通過間接ELISA法對收集的7種純化抗體進行效價檢測，結(jié)果（圖5）顯示7種單克隆抗體效價均在1∶240 000以上，符合要求。

圖3 重組蛋白Δmmp9的誘導(dǎo)表達

圖4 重組蛋白純化

2.7 配對單抗的篩選

采用雙抗夾心ELISA法篩選配對抗體。首先選擇C3B3B11作為捕獲抗體，分別以1∶5 000和1∶10 000的稀釋度包板，標(biāo)記抗體為HRP標(biāo)記后的7種單抗，標(biāo)記抗體以1∶10 000和1∶50 000稀釋，其他抗體對以此類推。初步配對實驗結(jié)果為：B4-4與其他6種單抗都有配對可能，可作為捕獲抗體，其他抗體作為其標(biāo)記抗體；D6G7與C3B3B11、5-9、A6A10有配對可能，D6G7可作為捕獲抗體，C3B3B11、5-9、A6A10可作為其標(biāo)記抗體；B8C5G10與C3B3B11、5-9、A6A10有配對可能，B8C5G10可作為捕獲抗體，C3B3B11、5-9、A6A10可作為其標(biāo)記抗體。

后續(xù)調(diào)整配對實驗條件，對3種捕獲抗體及其配對標(biāo)記抗體的工作濃度進一步調(diào)整，結(jié)果見圖6。圖6-A顯示，B4-4以1∶2 000作為捕獲抗體包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為 ：C3B3B11-HRP 為 1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為 1∶5 000-1∶10 000；A6A10-HRP為 1∶5 000；B8C5G10-HRP為1∶5 000；D10D8-HRP為1∶5 000-1∶10 000。圖6-B顯示，D6G7以1∶1 000-1∶2 000包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為：C3B3B11-HRP為1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為1∶1 000-1∶5 000；A6A10-HRP為1∶1 000-1∶5 000。圖6-C顯示，B5C5G10以1∶5 000包板效果較好，其配對的標(biāo)記抗體稀釋度依次為：C3B3B11-HRP為 1∶5 000-1∶10 000；5-9-HRP為1∶5 000-1∶10 000；A6A10-HRP 為 1∶5 000。

圖5 7種純化單克隆抗體效價

3 討論

近年來的臨床研究表明，MMP-9可以作為部分癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，甚至對一些癌癥和疾病具有預(yù)后診斷參考價值。王璐、王小俠等［22-23］對胃癌的臨床研究表明MMP-9高表達對腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移都具有促進作用。高晨［24］的研究也指出MMP-9基因表達水平有作為原發(fā)性肝癌復(fù)發(fā)、侵襲和轉(zhuǎn)移指標(biāo)的可能，同時部分臨床研究表明MMP-9有可能成為監(jiān)測慢性阻塞性肺疾病嚴重程度及惡化的更精確的指標(biāo)［25］。有研究證明通過監(jiān)測血清中MMP-9和TIMP-1的表達不止有助于確定乳腺癌的轉(zhuǎn)移情況［26］，對結(jié)直腸癌的預(yù)后診斷也有一定價值［27］。單體臻等［28］的臨床研究表明血清中MMP-2、MMP-9水平可成為阿爾茨海默病診斷的參考因子。在子宮內(nèi)膜癌的研究中，尿激酶型纖溶酶原激活劑（UPA）與MMP-9在子宮內(nèi)膜癌組織的陽性表達率顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織（P＜0.05），且兩者表達水平正相關(guān)，提示臨床聯(lián)合檢測二者有可能為評估子宮內(nèi)膜癌病變程度提供參考［29］。在膀胱移行細胞癌研究中，骨橋蛋白（OPN）和MMP-9在膀胱組織中表達升高與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，檢測OPN和MMP-9對膀胱移行細胞癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要參考價值［30］。因此，在臨床上MMP-9有作為新型腫瘤診斷標(biāo)記的潛能。

圖6 配對抗體稀釋度判定結(jié)果

本研究通過uniport數(shù)據(jù)庫獲取MMP-9基因序列，運用生物信息學(xué)的方法通過DNAstar-Protean、PBD分析其跨膜區(qū)、親水性、表面可及性、抗原指數(shù)［31-32］，預(yù)測出其抗原表位區(qū)。構(gòu)建原核重組表達載體，經(jīng)過誘導(dǎo)表達得到符合預(yù)期的重組蛋白Δmmp9，并獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的7株雜交瘤細胞株，效價均能達到1∶240 000，效價優(yōu)于abcam公司的MMP-9單克隆抗體（https：//www.abcam. cn/mmp9-antibody-5g3-ab119906-references.html#active-tab.）。運用雙抗夾心ELISA法將所得7種單抗進行配對抗體篩選，篩選出能與重組蛋白Δmmp9同時結(jié)合的配對抗體，下一步研究工作將采用醫(yī)院臨床樣本驗證優(yōu)化篩選出的配對抗體。本研究中的Δmmp9抗體可采用雙抗夾心法對不同類型樣本中MMP-9進行定性或定量檢測，為研發(fā)MMP-9的臨床檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測MMP-9的抗原表位區(qū)，構(gòu)建原核表達載體，并在大腸桿菌BL21（DE3）中實現(xiàn)高效表達。通過純化其重組蛋白，免疫動物、單克隆篩選獲得7株穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細胞株，檢測其單抗效價均達到1∶240 000。通過抗體配對實驗，得到3種捕獲抗體及其對應(yīng)的標(biāo)記抗體，且確定了其有效工作濃度。