葡萄柚中糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)槲皮素及其類似物催化機(jī)制探討

葉靜斯 竇文芳 王程

（江南大學(xué)藥學(xué)院，無錫 214122）

植物糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferase，GT）是一類與多糖、糖脂、糖蛋白、植物次生產(chǎn)物、核酸等生物分子的代謝密切相關(guān)的酶［1-2］，在植物細(xì)胞中廣泛存在，其主要作用方式是通過產(chǎn)生糖苷鍵將供體糖分子或相關(guān)基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特異性受體上［3］。植物中的糖苷鍵相關(guān)受體很多，如甘露糖（Man）類糖蛋白、糖核苷酸等，形成的糖蛋白與相關(guān)糖核酸在植物的種子萌發(fā)、幼苗生長、生殖和應(yīng)激等生命過程中均起重要作用［4］。

槲皮素（Quercetin）又名櫟精、槲皮黃素，屬于黃酮類化合物，分子式為C15H10O7，難溶于水，可溶于甲醇、冰醋酸、丙酮和堿等。人類日常食物中不僅含有槲皮素自由形態(tài)，還存在糖苷的形式，例如蘆丁和槲皮苷。近年來國內(nèi)外研究表明，槲皮素有很多功效，包括抗癌作用［5-6］、抗氧化作用［7］、抗炎作用［8-9］、抗病毒作用［10-11］及心血管保護(hù)作用［12］等。但是槲皮素的水溶性較差，在一定程度上影響了它們的開發(fā)和利用。因此，需要對(duì)這些化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造。而糖基化的主要目的是提高天然產(chǎn)物在水相中的溶解性，從而使一些化合物的理化性質(zhì)和生理活性發(fā)生改變。改變水溶性的方法主要是糖基化，化學(xué)合成的方法存在缺乏區(qū)域、立體化學(xué)選擇性，專一性差等缺點(diǎn)，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)卻可以彌補(bǔ)化學(xué)合成的不足［13］。

Ko等［14］以來源于蠟狀芽胞桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶（BcGT-1）對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化反應(yīng)，糖基化發(fā)生在槲皮素的3位及7位羥基上，該轉(zhuǎn)化體系以UDP（尿苷二磷酸）-葡萄糖為糖基供體，槲皮素為糖基受體，分別得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-7-O-葡萄糖苷。Lim 等［15］以來源于擬南芥的7種尿苷二磷酸葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化修飾，該轉(zhuǎn)化反應(yīng)以UDP-葡萄糖為糖基供體，糖基化位置分別在槲皮素的3、7、3′和4′位羥基，得到6種不同的糖基化產(chǎn)物。Son等［16］以蔗糖合成酶與糖基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化，反應(yīng)以UDP-葡萄糖為糖基供體，槲皮素為糖基受體時(shí)，得到槲皮素-7，3′ -2-O-葡萄糖苷。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［14-18］，糖基化反應(yīng)的酶多是來源于微生物體內(nèi)，且其反應(yīng)會(huì)生成多個(gè)產(chǎn)物，這對(duì)產(chǎn)物的純化造成一定的困難，并且天然黃酮類糖基化多發(fā)生在植物當(dāng)中，所以本實(shí)驗(yàn)研究的是葡萄柚中的糖基轉(zhuǎn)移酶（FGT），對(duì)槲皮素、柚皮苷、柚皮素進(jìn)行糖基化。以FGT作為糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖基化的研究較少，并且所得到的糖苷產(chǎn)物為單一性產(chǎn)物，簡化了后續(xù)的純化操作。本研究給未來槲皮素糖基化的工業(yè)制備提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種的來源 基因工程菌Escherichia coli BL21 / pGEX-4T-1-FGT由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。

1.1.2 試劑與儀器 槲皮素、柚皮素、柚皮苷購買于成都德銳可生物科技有限公司；AB-8大孔吸附樹脂、Sephadex LH-20填料購買于北京英萊克科技發(fā)展有限公司；實(shí)驗(yàn)中所涉及的所有試劑均來自于上海生物工程生物科技有限公司，乙腈為HPLC級(jí)別；高效液相色譜（安捷倫公司，規(guī)格型號(hào)：1260）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的表達(dá)與純化 將實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的工程菌培養(yǎng)在含終濃度0.1 g/L氨芐青霉素的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃。培養(yǎng)基的OD600達(dá)到0.8后，添加異丙基-1-硫代-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的最終濃度為 4×10-4mol/L，20℃下10-12 h。離心收集菌體（10 000 r/min，10 min，4℃），再用 1-2 mL buffer（2×10-2mol/L Tris-HCl，pH7.3）重懸，4℃下5 min，棄上清后-80℃保存菌體。菌體破碎采用反復(fù)凍融的方法，用裂解緩沖液（5×10-2mol/L Tris-HCl，pH 8.0；1×10-1mol/L NaCl；5×10-3mol/L EDTA；1 g/L溶菌酶；1×10-3mol/L DTT）稀釋10倍。目標(biāo)蛋白用GST標(biāo)簽柱純化。該純化的酶用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢驗(yàn)，并加10%甘油保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 酶濃度的測定 蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）［19］。采用Bradford蛋白濃度試劑盒對(duì)所純化的蛋白進(jìn)行濃度的測定。

蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的制備：把5 mg/L牛血清蛋白，用 1×PBS 稀釋為 ：10、20、40、60、80、100、120 μg/mL。

分光光度法：分別取不同稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)液100 μL，加入到1.5 mL離心管中，再加入1 mL Bradford工作液，迅速混勻。室溫下反應(yīng)5 min后，在分光光度計(jì)上測各管的A595值。根據(jù)所測的數(shù)據(jù)得到線性方程，后續(xù)純化得到的蛋白可以根據(jù)線性方程得到相應(yīng)的蛋白濃度。酶液檢測的A595值帶入下列方程中，可直接得到酶濃度。計(jì)算公式如下：

1.2.3 酶催化反應(yīng) 將已純化的FGT酶進(jìn)行催化反應(yīng)，反應(yīng)體系包括：40 μL 2×10-2mol/L的不同黃酮（槲皮素、柚皮素、柚皮苷）和20 μL 1×10-2mol/L UDP-糖（UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖、UDP-甘露糖），50 μL 5×10-2mol/L pH 7.0的 Tris-HCl緩沖液和 25 μL 5×10-2mol/L MgCl2，85 μL 去離子水，混合后，加入150 μL 0.4 g/L FGT酶。相同體系下不加FGT酶為對(duì)照組。在35℃下反應(yīng)16-24 h。產(chǎn)物用高效液相色譜（HPLC）檢測。

1.2.4 酶催化反應(yīng)條件的研究

1.2.4.1 pH對(duì)酶活的影響 研究pH對(duì)酶活性的影響，pH的區(qū)間為3.0-9.0，溫度35℃，采用的緩沖液分別為：5×10-2mol/L檸檬酸緩沖液，pH 3.0-5.0；5×10-2mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩 沖 液，pH 6.0-7.0；5×10-2mol/L Tris-HCl，pH 8.0-9.0。產(chǎn)物的量用HPLC方法來定量。制作出產(chǎn)物的量與反應(yīng)pH的曲線圖。

1.2.4.2 溫度對(duì)酶活的影響 研究溫度對(duì)酶活性的影響，溫度的測量范圍為20-45℃，底物為槲皮素與UDP-葡萄糖，pH 7.0，產(chǎn)物的量用HPLC方法來定量。制作出產(chǎn)物的量與反應(yīng)溫度的曲線圖。

1.2.5 槲皮素糖苷分離純化

1.2.5.1 AB-8大孔吸附樹脂分離純化［20］預(yù)處理方法：先用3%的氫氧化鈉溶液浸泡24 h，再用蒸餾水清洗至pH值為中性，濕法裝柱，用2-3倍柱體積的95%乙醇洗柱，最后用蒸餾水洗去乙醇即可。將反應(yīng)液濃縮，濃縮后的樣品在AB-8大孔吸附樹脂中吸附3 h，后用大量的蒸餾水洗脫，再用80%乙醇洗脫，收集洗脫液。

1.2.5.2 Sephadex LH-20 柱分離純化［21］預(yù)處理方法：用50%甲醇溶液溶脹填料5 h，濕法裝柱，用10倍柱體積的50%甲醇低流速清洗。乙醇樣品濃縮后，上樣。先用50%甲醇溶液洗脫，收集槲皮素糖苷樣品，再用80%甲醇溶液洗脫槲皮素。

1.2.6 產(chǎn)物檢測方法

1.2.6.1 HPLC檢測 得到的反應(yīng)液經(jīng)過0.22 μm孔徑的濾膜過濾，使用安捷倫TC-C18，150×4.6 mm柱。液相檢測方法，槲皮素：緩沖液A為含0.1%磷酸的水溶液，緩沖液B為乙腈，運(yùn)行程序：0 min 75%B到15 min 60% B，流速1 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，370 nm，溫度為30℃。柚皮素、柚皮苷：緩沖液A為含0.1%磷酸的水溶液，緩沖液B為乙腈，運(yùn)行程序：0 min 75% B到30 min 5% B，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，285 nm，溫度30℃。

1.2.6.2 槲皮素糖苷的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）檢測分析 WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS（WATERS，UK）進(jìn)行MS分析。采用負(fù)離子化方式，毛細(xì)管電壓為3.5 KV，加熱溫度為100℃。檢測槲皮素糖苷分子量。

1.2.6.3 槲皮素糖苷的核磁氫譜（NMR）檢測分析 冷凍干燥的樣品用氘代-二甲基亞砜溶解，在Aduance Ⅲ 400 MHZ質(zhì)譜儀上檢測糖苷產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 FGT純化及濃度測定結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的FGT酶信息可得，目的蛋白的大小為76.7 kD。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）結(jié)果（圖1）顯示，所純化得到的蛋白為目的蛋白FGT酶，圖中在26 kD左右的位置出現(xiàn)的條帶為在純化過程中斷裂的GST標(biāo)簽。

圖1 FGT酶純化SDS-PAGE結(jié)果

2.2 酶催化反應(yīng)體系

用HPLC分別對(duì)9種組合反應(yīng)液進(jìn)行檢測驗(yàn)證（圖2）。圖2-A-C為槲皮素作為底物的反應(yīng)，糖基供體依次為UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖、UDP-甘露糖，相同反應(yīng)時(shí)間，HPLC檢測圖譜顯示，以UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體時(shí)，在4 min左右出現(xiàn)了一個(gè)新的吸收峰，表示生成了新的產(chǎn)物。11 min左右的吸收峰為未反應(yīng)的槲皮素。而UDP-甘露糖卻沒有生成新的物質(zhì)，說明FGT酶可以催化槲皮素與UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)。圖2-D-F為柚皮苷作為底物的反應(yīng)，糖基供體依次為UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖、UDP-甘露糖，HPLC檢測結(jié)果顯示并沒有新的物質(zhì)生成。圖2-G-I為柚皮素作為底物的反應(yīng)，糖基供體依次為UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖、UDP-甘露糖，HPLC檢測結(jié)果顯示沒有新的物質(zhì)生成。

圖2 FGT催化糖基化反應(yīng)結(jié)果HPLC分析

2.3 酶催化反應(yīng)條件

2.3.1 pH對(duì)FGT酶活力的影響 實(shí)驗(yàn)以槲皮素和UDP-葡萄糖作為底物，pH 設(shè)置為 3、4、5、6、7、8、9。通過HPLC結(jié)果分析，pH 7的產(chǎn)物量最高，所以以pH 7產(chǎn)物量做對(duì)照，制作了一個(gè)曲線圖來探究出其他pH值的相對(duì)活性（圖3-A）。pH 3、4相對(duì)活性為0，即在這兩種pH環(huán)境下酶喪失活性，HPLC檢測沒有生成新的產(chǎn)物。pH 5相對(duì)比活為24.87%，pH 6相對(duì)比活為46.15%，pH 8相對(duì)比活為58.97%，pH 9相對(duì)比活為17.44%。

2.3.2 溫度對(duì)FGT酶活力的影響 實(shí)驗(yàn)以槲皮素和UDP-葡萄糖作為反應(yīng)底物，溫度設(shè)置為20℃、25℃、30℃、35℃、40℃（圖3-B）。以35℃為對(duì)照，計(jì)算其他溫度相對(duì)活性。20℃相對(duì)比活為50%，25℃相對(duì)比活為65%，30℃相對(duì)比活為68%，40℃相對(duì)比活為34%。

2.4 槲皮素糖苷分離純化結(jié)果

反應(yīng)液經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂除去雜質(zhì)、Sephadex LH-20柱純化得到槲皮素糖苷，分離的效果用HPLC檢測，得到的結(jié)果如圖4 所示。圖4-A-C為槲皮素與UDP-葡萄糖糖基化反應(yīng)生成的糖苷純化HPLC檢測圖譜，圖4-A為反應(yīng)后的HPLC圖譜，圖中4 min左右出現(xiàn)的峰為目標(biāo)產(chǎn)物槲皮素糖苷，11 min左右出現(xiàn)的峰為槲皮素；圖4-B為經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂純化后的HPLC檢測圖譜，與圖A對(duì)比，去除了2-3 min之間的雜質(zhì)；圖4-C為經(jīng)過Sephadex LH-20柱得到的糖苷HPLC檢測圖譜，結(jié)果表明，可以得到較純的槲皮素葡萄糖苷。圖4-D-F為槲皮素與UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖糖基化反應(yīng)生成的糖苷純化HPLC檢測圖譜，圖4-D為反應(yīng)后的HPLC圖譜，圖中4.1 min左右出現(xiàn)的峰為目標(biāo)產(chǎn)物，11 min左右出現(xiàn)的峰為槲皮素；圖4-E為經(jīng)過AB-8大孔吸附樹脂純化后得到的HPLC圖譜，與圖4-D比較，去除了1-3 min的雜質(zhì)；圖4-F為經(jīng)過Sephadex LH-20柱純化后得到的糖苷產(chǎn)物的HPLC圖譜，結(jié)果表明，可以得到較純的槲皮素N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷產(chǎn)物。HPLC檢測結(jié)果顯示，通過兩種柱分離的方法可以得到純度較高的槲皮素糖苷產(chǎn)物。

圖3 pH與溫度對(duì)酶活影響

2.5 槲皮素糖苷的質(zhì)譜分析

對(duì)能夠產(chǎn)生新物質(zhì)的反應(yīng)體系做進(jìn)一步MS檢測。本實(shí)驗(yàn)中，檢測使用的是負(fù)離子源，槲皮素的分子量為302，葡萄糖分子量為180，當(dāng)葡萄糖分子結(jié)合到槲皮素上時(shí)會(huì)脫去一分子水，故而產(chǎn)物的分子量為464。所以根據(jù)負(fù)離子源時(shí)會(huì)產(chǎn)生失去氫峰，分子量減少1，所以質(zhì)譜圖中顯示的是463（圖5-A），證明反應(yīng)生成的產(chǎn)物為槲皮素-葡萄糖苷。同理，UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖的分子量為221，與槲皮素結(jié)合后脫去一分子水后分子量為505，質(zhì)譜檢測采用的是負(fù)離子源，所以顯示的分子量為504（圖5-B）。證明反應(yīng)生成了槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷。

圖4 酶催化產(chǎn)物的HPLC檢測結(jié)果

2.6 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析

氫原子具有磁性，如電磁波照射氫原子核，它能通過共振吸收電磁波能量，發(fā)生躍遷。用核磁共振儀可以記錄到有關(guān)信號(hào)，處在不同環(huán)境中的氫原子因產(chǎn)生共振時(shí)吸收電磁波的頻率不同，在圖譜上出現(xiàn)的位置也不同，各種氫原子的這種差異被稱為化學(xué)位移（ppm）。槲皮素結(jié)構(gòu)如圖 6 所示。槲皮素葡萄糖苷的核磁共振氫譜分別如圖 7 所示。將 6、8、2′、5′位的氫原子的化學(xué)位移分別同槲皮素進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表1所示。槲皮素 6、8、2′、5′ 化學(xué)位移分別為 6.19、6.41、7.68、6.89 ppm。目標(biāo)產(chǎn)物 A（槲皮素葡萄糖苷）在 6、8、2′、5′ 化學(xué)位移分別為 6.15、6.34、7.57、6.83 ppm，且多了一個(gè)新的化學(xué)位移 5.44ppm，相比較槲皮素，6、8、2′、5′化學(xué)位移幾乎沒有改變，這表明并沒有在A、B環(huán)出現(xiàn)糖苷信號(hào)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象表明糖苷分子連接在C環(huán)的3號(hào)位，且是β連接。同理，目標(biāo)產(chǎn)物B（槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷）在 6、8、2′、5′ 化學(xué)位移分別為 6.20、6.44、7.64、6.86 ppm，且多了一個(gè)新的化學(xué)位移 5.60ppm，相比較槲皮素 6、8、2′、5′化學(xué)位移幾乎沒有改變，所以根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［22］得知糖苷分子連接在C環(huán)的3號(hào)位，且是β連接。推測出來的結(jié)構(gòu)圖如圖8 所示。

圖5 槲皮素糖苷產(chǎn)物質(zhì)譜檢測

圖6 槲皮素的結(jié)構(gòu)式

圖7 槲皮素糖苷的1H-NMR譜圖

表1 槲皮素糖苷的部分氫譜數(shù)據(jù)

3 討論

槲皮素大量存在于各種植物以及日常食物和飲料中，如洋蔥、蘋果、漿果、西蘭花、茶和紅葡萄酒。并且槲皮素有很多功效，包括抗癌作用［5-6］、抗氧化作用［7］、抗炎作用［8-9］、抗病毒作用［10-11］、心血管保護(hù)作用［12］等。盡管槲皮素有如此多的生理活性功能，但槲皮素水溶性低，生物利用度差，而對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化修飾后，可以明顯提高水溶性。糖基化方法主要有酶法制備和化學(xué)合成，化學(xué)合成的方法存在缺乏區(qū)域、立體化學(xué)選擇性及專一性差等缺點(diǎn)，生物轉(zhuǎn)化技術(shù)卻可以彌補(bǔ)化學(xué)合成的不足［13］。

本研究采用葡萄柚中的糖基轉(zhuǎn)移酶FGT對(duì)黃酮類化合物進(jìn)行糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)FGT酶可以以UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖為糖基供體和槲皮素進(jìn)行反應(yīng)，HPLC檢測出新物質(zhì)。根據(jù)槲皮素-3-O-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，可以確定以UDP-葡萄糖為糖基供體的反應(yīng)生成了槲皮素糖苷，但是由于沒有槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，所以只能根據(jù)HPLC檢測結(jié)果和槲皮素-3-O-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰位置，推斷4.1 min左右出峰位置為槲皮素-N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷。根據(jù)糖苷性質(zhì)對(duì)兩種產(chǎn)物分離純化，質(zhì)譜檢測后，驗(yàn)證了我們的推斷正確，再用核磁共振氫譜檢測確定兩種糖苷的結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)所采用的是來源于植物中的糖基轉(zhuǎn)移酶，相比來源于微生物體內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶（如源于蠟狀芽孢桿菌的糖基轉(zhuǎn)移酶（BcGT-1）對(duì)槲皮素進(jìn)行糖基化反應(yīng)，該轉(zhuǎn)化體系以UDP（尿苷二磷酸）-葡萄糖為糖基供體，槲皮素為糖基受體，分別得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷和槲皮素-7-O-葡萄糖苷［14］），我們獲得的兩種糖苷都發(fā)生在槲皮素的3號(hào)位上，相比較而言，F(xiàn)GT酶的專一性更強(qiáng)，且生成單一產(chǎn)物，有利于簡化產(chǎn)物純化操作過程。

然而，目前我們的研究還不夠完善，接下來可以進(jìn)行體內(nèi)體外抗氧化活性研究，全方位比較槲皮素與槲皮素糖苷生理活性的差異性。此外還需要對(duì)FGT酶轉(zhuǎn)糖基作用機(jī)理的研究，因?yàn)镕GT酶目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道過，所以這有利于為后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究奠定重要基礎(chǔ)。

圖8 槲皮素糖苷分子結(jié)構(gòu)圖

4 結(jié)論

以FGT作為催化酶，對(duì)黃酮類物質(zhì)進(jìn)行糖基化。參與反應(yīng)的糖基受體為槲皮素、柚皮素、柚皮苷，糖基供體為：UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖、UDP-甘露糖。經(jīng)HPLC檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)GT僅可以催化槲皮素作為糖基受體，可與其發(fā)生反應(yīng)的糖基供體為UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰-D-氨基葡萄糖。對(duì)生成物進(jìn)行質(zhì)譜檢測，生成產(chǎn)物的分子量分別為463、504。進(jìn)一步用核磁共振氫譜鑒定結(jié)構(gòu)，初步判定兩個(gè)糖苷產(chǎn)物分別為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-乙酰-D-氨基葡萄糖苷。酶的最適溫度和pH分別為35℃和7.0。