低溫萘降解菌的篩選、鑒定及降解條件優(yōu)化

郭亞男 張馨予 胥夢(mèng) 王繼華

（哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025）

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種具有兩個(gè)或多個(gè)苯環(huán)的有機(jī)污染物，在環(huán)境中廣泛存在［1］。主要來(lái)源于森林火災(zāi)、火山噴發(fā)或化石燃料的不完全燃燒［2-3］。由于PAHs具有低溶解度，高疏水性，高辛醇-水分配系數(shù)（KOW）和降解的頑固性等特性，使其在環(huán)境中積累到高水平，在我國(guó)東北污灌區(qū)、天津地區(qū)等部分地區(qū)土壤中均有檢出［4-6］。迄今已發(fā)現(xiàn)200多種PAHs，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署列舉出16種優(yōu)先修復(fù)的PAHs，萘為其中一種，萘因具有揮發(fā)性使它更容易與受體接觸，導(dǎo)致患溶血性貧血、皮膚病、視網(wǎng)膜炎及細(xì)胞癌變等疾?。?-9］。土壤中的萘可被植物吸收，進(jìn)入食物鏈，對(duì)人類(lèi)健康和生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅［10］。微生物修復(fù)是一種治理環(huán)境污染的有效方法，與其他方法相比，經(jīng)濟(jì)、高效且無(wú)二次污染［11-13］。只要正確的利用微生物群體，它們便利用土壤中的萘作為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)，且細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能夠?yàn)樯镄迯?fù)提供一種更快速、更均勻地降解萘的手段［14-16］。

根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，PAHs污染北方較南方嚴(yán)重，冬季PAHs的排放量大約是夏季的1.6倍［17］。國(guó)內(nèi)城市土壤中的PAHs主要來(lái)源于高溫燃燒源和石油源所構(gòu)成的混合型污染［18］。我國(guó)北方年平均氣溫低于15℃，在此溫度下許多最佳生長(zhǎng)溫度在20℃及以上的萘降解菌無(wú)法發(fā)揮其降解能力，而在15℃或以下恰恰是低溫微生物的最適生長(zhǎng)溫度。因此，篩選對(duì)萘具有強(qiáng)降解能力的低溫微生物是十分必要的。而北方土壤內(nèi)的土著菌已長(zhǎng)期適應(yīng)了寒冷環(huán)境，因此篩選萘的低溫降解菌，選擇北方地區(qū)石油污染較嚴(yán)重的地區(qū)作為降解菌株的源土壤。大慶市，別稱油城，是一座以石油、石化為支柱產(chǎn)業(yè)的著名工業(yè)城市。但是在開(kāi)采過(guò)程中無(wú)法避免石油泄漏問(wèn)題，由此產(chǎn)生萘污染的環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重。并且該區(qū)域的日平均氣溫低于15℃，持續(xù)6-9個(gè)月。因此，研究從黑龍江省大慶油田地區(qū)污染土壤篩選能以萘為唯一碳源和能源的降解菌，研究降解菌在萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)萘的降解情況；得到高效降解菌對(duì)其進(jìn)行鑒定；對(duì)高效降解菌的生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)分析降解階段其主控因素。旨為在低溫條件下利用微生物修復(fù)技術(shù)治理PAHs污染提供優(yōu)良菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 土樣取自黑龍江省大慶市紅崗區(qū)圖強(qiáng)西街油田石油污染土壤表層（0-10 cm），地理坐標(biāo)為：緯度46.522217，經(jīng)度124.945595。采用五點(diǎn)采樣法取樣后帶回實(shí)驗(yàn)室，過(guò)20 mm篩，保存于4℃冰箱。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，1×105Pa滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0-7.2，1×105Pa滅菌20 min。檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：NH4H2PO41 g，K2HPO41 g，NaCl 5 g，MgSO40.2 g，檸檬酸鈉 2 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴香酚藍(lán)乙醇溶液，10 mL，1×105Pa滅菌20 min。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.5 g，Na2HPO4·2H2O 3.5 g，MgCl2·6H2O 0.1 g，Ca（NO3）2·4H2O 0.05 g，KH2PO41 g，蒸餾水1 000 mL，1×105Pa滅菌20 min。萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：將萘溶解于正己烷溶液，待正己烷完全揮發(fā)，萘晶體析出后，加入預(yù)先滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基均勻混合。

1.2 方法

1.2.1 低溫降解菌馴化、分離及篩選方法 微生物的馴化過(guò)程是通過(guò)人為措施使得微生物逐步適應(yīng)某種環(huán)境，最后獲得具有較高耐受力和活力的菌株。萘對(duì)菌體有一定的毒害作用，最大污染物濃度馴化法使得能夠適應(yīng)該污染物濃度的菌株存活下來(lái)，并隨著馴化的進(jìn)行漸漸適應(yīng)該環(huán)境而進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。取5 g土樣裝入含有200 mL萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（萘濃度200 mg/L）的錐形瓶中，10℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，7 d后觀察培養(yǎng)液變化。按體積10%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，萘濃度增加至400 mg/L，此后，萘的質(zhì)量濃度按600、800、1 000 mg/L逐步提升。吸取5代培養(yǎng)液采用稀釋涂布法分離純化，選擇菌落生長(zhǎng)較好的菌株在萘-無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上劃線復(fù)篩，-80℃甘油保存。

1.2.2 萘降解率的測(cè)定

1.2.2.1 菌懸液的制備 將所得菌株接入LB液體培養(yǎng)基中，10℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，選擇對(duì)數(shù)期菌株離心收集細(xì)菌（10 000 r/min，6 min），用無(wú)菌水重復(fù)沖洗3次，用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌懸液調(diào)節(jié)至所需菌濃度。

1.2.2.2 菌株對(duì)萘的降解 將所得菌株接入200 mL的萘-無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（萘濃度為300 mg/L）中，在10℃、120 r/min下振蕩培養(yǎng)，3個(gè)重復(fù)，設(shè)立不接菌液為對(duì)照組。24 h取樣一次。取樣吸取5 mL樣品加入裝有2 g氯化鈉和5 mL正己烷溶液的離心管中，用旋渦混合器混勻2 min，離心（5 000 r/min，5 min），轉(zhuǎn)移上清液正己烷層至玻璃小瓶中。再用5 mL正己烷重復(fù)上述萃取過(guò)程后，合并上清液用無(wú)水Na2SO4脫水，30℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，氮吹1 mL以下，正己烷定容至1 mL，待測(cè)。

Agilent 7890/5975C-GC/MSD檢測(cè)程序設(shè)定：進(jìn)樣口溫度280℃，分流進(jìn)樣，載氣：氦氣（高純），流量 1 μL/min（恒流），進(jìn)樣量 ：1.0 μL，色譜柱DB5-MS（15 m×0.25 mm，0.1 μm），升溫程序：80℃，保持2 min；以20℃/min升至180℃，保持5 min；再以10℃/min速率升至240℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度、離子化能量、接口溫度、四極桿溫度分別為230℃、70 eV、280℃和150℃，溶劑延遲5 min，離子檢測(cè)（SIM）模式。

1.2.2.3 萘的標(biāo)準(zhǔn)曲線 萘儲(chǔ)備液按照梯度稀釋，分別稀釋配制成濃度為20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L和100 mg/L的溶液。用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定萘各濃度時(shí)對(duì)應(yīng)的峰面積，以萘各梯度標(biāo)準(zhǔn)液濃度為X，對(duì)應(yīng)的峰面積為Y，制作萘標(biāo)準(zhǔn)線Y=2613.9X-7146.4，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.999。

1.2.3 低溫降解菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征 所得菌株接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，10℃培養(yǎng)7 d，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、菌體大小。生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照鑒定手冊(cè)［19］。

1.2.3.2 16S rDNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析 利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（HaiGene，B0135）提取細(xì)菌DNA，并利用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)細(xì)菌 16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL擴(kuò)增體系為：DNA模板 2 μL，Super Taq DNA Polymerase 0.5 μL，10×Hi PCR Buffer 5.0 μL dNTP Mixture 4.0 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L） 和 PCR Reverse Primer（10 μmol/L）各 PCR Reverse Primer（10 μmol/L），ddH2O Up to 50 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃30 s；51℃ 1 min 30 s，72℃ 2 min 30 s，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 10 min。經(jīng)篩選后的菌株送至哈爾濱瑞博興科生物技術(shù)有限公司完成16S rDNA測(cè)序工作。通過(guò)MEGA 7.0軟件Alignment中的CLUSTAL W對(duì)目的序列和參考序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果選擇Bootstrap test of phylogeny并用Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 降解菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將所得菌株接入200 mL的LB液體培養(yǎng)基中，10℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，4 h取樣1次，3個(gè)重復(fù)，設(shè)立不接菌液為對(duì)照組（CK）。用UV759CRT紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光值（OD600）表示菌株的生長(zhǎng)量。

1.2.5 降解菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化 萘-無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)萘濃度、培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測(cè)量菌液OD600。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，添加時(shí)間因素，按正交試驗(yàn)L18（35）五因素三水平共18組試驗(yàn)對(duì)菌株搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 利用 IBM SPSS Statistics 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 低溫萘降解菌的篩選

從黑龍江省大慶油田附近污染土壤中，采用污染物濃度馴化法進(jìn)行菌株的馴化。在馴化后期以萘為唯一碳源（1 000 mg/L）富集體系中初篩，富集過(guò)程初始溶液為無(wú)色，從2 d開(kāi)始有顯色變化，變?yōu)槌壬?，顏色逐漸加深。富集體系結(jié)束后將富集液采用稀釋涂布法涂LB培養(yǎng)基平板，選擇菌落生長(zhǎng)較好的菌株在萘-無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中復(fù)篩，最終得到5株以萘為唯一碳源生長(zhǎng)的低溫菌株。

2.2 低溫萘降解菌降解能力的結(jié)果與分析

對(duì)5株低溫萘降解菌在萘-無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（萘濃度300 mg/L）中培養(yǎng)10 d，萘的降解情況測(cè)定如圖1所示。1號(hào)菌對(duì)萘污染物的毒性適應(yīng)能力較強(qiáng)，呈勻速上升趨勢(shì)，具有較好的降解能力。2號(hào)菌初期能較快降解萘，72 h之后降解速率下降，降解率增長(zhǎng)緩慢。3號(hào)和4號(hào)菌各階段降解趨勢(shì)基本保持一致，相對(duì)于其他菌株具有更強(qiáng)的降解能力，降解速度從培養(yǎng)初期即開(kāi)始上升，第1天至3天上升得最快，3 d后上升的速度減緩。與培養(yǎng)初期相比，4 d內(nèi)在添加3號(hào)菌和4號(hào)菌的處理中，在對(duì)照組非生物因素影響基礎(chǔ)上，萘的降解率達(dá)94.43%和95.47%，在耐受能力和降解速度方面具明顯優(yōu)勢(shì)。5號(hào)菌相比較于其他菌株適應(yīng)能力較慢，但經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，降解率持續(xù)增加。根據(jù)不同菌株在低溫條件下對(duì)萘的適應(yīng)能力以及自身生長(zhǎng)狀況，最終選擇3號(hào)和4號(hào)菌作為下一步研究對(duì)象進(jìn)行研究。并將3號(hào)、4號(hào)菌命名為GN1和GN2。

圖1 不同低溫萘降解菌降解能力測(cè)定

2.3 低溫萘降解菌的鑒定

采用形態(tài)觀察及生理特性對(duì)GN1和GN2菌株初步鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。

菌株GN1和GN2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果如圖2所示。根據(jù)16S rDNA序列同源性比對(duì)，GN1和GN2皆與假單胞菌屬（Pseudomonassp.）同源性最近，序列相似性均高達(dá)99%。綜合菌株的形態(tài)觀察、生理生化特性及16S rDNA序列比對(duì)分析，可確定GN1和GN2均屬于假單胞菌屬。GN1和GN2所測(cè)序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列登錄號(hào)分別為MK208705和 MK208706。

2.4 低溫萘降解菌的生長(zhǎng)曲線

菌株GN1和GN2的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3，2株菌均適宜在LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，GN1、GN2從接種到第8小時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，延滯期較短；從8 h到60 h，細(xì)胞數(shù)量急劇增加，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；60 h后，隨著培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的消耗，細(xì)菌細(xì)胞密度變化不大，細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期。其中GN1生物量略高于GN2。

表1 GN1和GN2降解菌的形態(tài)及生理生化特征

2.5 菌株GN1和GN2培養(yǎng)條件優(yōu)化

菌株GN1和GN2培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖4。GN1和GN2最優(yōu)單因素培養(yǎng)條件均為：萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（萘濃度300 mg/L），pH 7.0，培養(yǎng)溫度10℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)120 r/min。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的因素和水平（表2），按正交試驗(yàn)L18（35）對(duì)菌株GN1、GN2搖瓶培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析，菌株GN1結(jié)果見(jiàn)表3。各因素各水平之間差異顯著，說(shuō)明各個(gè)因素之間具有交互作用，5個(gè)因素對(duì)菌株GN1生長(zhǎng)影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋号囵B(yǎng)時(shí)間＞培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)＞培養(yǎng)溫度＞初始pH＞萘濃度。水平之間差異顯著，進(jìn)行多重比較，結(jié)合單因素統(tǒng)計(jì)量表（未給出）可得，GN1的最佳搖瓶培養(yǎng)條件組合為A3B3C1D3E3，即萘濃度300 mg/L，培養(yǎng)溫度15℃，初始pH 6.0，培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間7 d，在此條件下萘的去除率達(dá)到99.1%。菌株GN2結(jié)果見(jiàn)表4，同理，5個(gè)因素對(duì)菌株GN2生長(zhǎng)影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋号囵B(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)＞培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞初始pH＞萘濃度，GN2的最佳搖瓶培養(yǎng)條件組合為A3B3C1D3E3，即萘濃度300 mg/L，培養(yǎng)溫度15℃，初始pH 6.0，培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，在此條件下，萘的去除率達(dá)到99.8%。

圖2 基于16S rDNA基因序列同源性的GN1和GN2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 降解菌株生長(zhǎng)曲線

表2 正交試驗(yàn)環(huán)境因素和水平的設(shè)計(jì)

表3 GN1正交試驗(yàn)的方差分析

表4 GN2正交試驗(yàn)的方差分析

3 討論

微生物修復(fù)技術(shù)已成為人們選擇去除環(huán)境中萘的首要辦法和手段，篩選出能夠降解萘的菌株是該技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［20］。大量研究表明多個(gè)菌屬的細(xì)菌可對(duì)多數(shù)有機(jī)物進(jìn)行降解，尤其是假單胞菌屬，如孟建宇等［21］從烏梁素海水中篩選出一株假單胞菌，在10 d內(nèi)可降解質(zhì)量濃度為3.5 g/L的萘。但是目前研究多數(shù)萘的降解菌最適生長(zhǎng)溫度通常為25-37℃，低溫萘降解菌的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)篩選出的低溫萘降解菌測(cè)定其降解效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，在未加菌液的對(duì)照組中，萘的濃度也有所降低，在控制其他環(huán)境因素（萘濃度、溫度、pH和轉(zhuǎn)數(shù)）一致的情況下，可能是由于在降解過(guò)程中體系不是完全的密閉以及在取樣過(guò)程中的揮發(fā)所造成的；同時(shí)在降解過(guò)程中可能存在光化學(xué)降解，Bertilsson［22］對(duì)淡水中多環(huán)芳烴的光化學(xué)降解及其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響-水化學(xué)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在實(shí)驗(yàn)期間，觀察到存在光化學(xué)誘導(dǎo)所致的萘消耗，因此萘可能會(huì)發(fā)生光降解，此實(shí)驗(yàn)萘的光降解速率實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中可能由于光降解產(chǎn)生的降解結(jié)果類(lèi)似。綜合這兩方面，可能是本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組降解率略高的原因。有關(guān)多環(huán)芳烴降解菌降解效率的研究，多數(shù)在實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有加入空白組對(duì)照，這可能也是日后研究需要關(guān)注的地方。在低溫條件下GN1和GN2可以快速降解萘，在對(duì)照組非生物因素影響基礎(chǔ)上，萘（300 mg/L）的降解率在4 d內(nèi)達(dá)到94.43%和95.47%，在耐受能力和降解速度方面具明顯優(yōu)勢(shì)。為低溫條件下利用微生物修復(fù)技術(shù)治理PAHs污染提供了優(yōu)良菌株資源，同時(shí)降解動(dòng)態(tài)研究曲線也為菌株投入實(shí)際應(yīng)用提供了時(shí)間參比。

圖4 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株GN1、GN2生長(zhǎng)的影響

東北地區(qū)是我國(guó)重要的老工業(yè)基地之一，能源消耗較大，各類(lèi)燃料的燃燒效率較低，且氣候寒冷，取暖期漫長(zhǎng)，常溫菌無(wú)法發(fā)揮降解作用，由此產(chǎn)生的萘污染以及自然過(guò)程和人為過(guò)程導(dǎo)致土壤酸化問(wèn)題日益嚴(yán)重［23-25］。在過(guò)去的20年中國(guó)土壤pH平均下降0.5個(gè)單位［26］。污染和酸化已成為土壤生態(tài)系統(tǒng)的兩大威脅。本研究富集篩選出的菌株GN1、GN2能在低溫（0-15℃）、偏酸（pH 6.0）和萘質(zhì)量濃度為50-300 mg/L的條件中正常生長(zhǎng)。因此，GN1、GN2菌具有較好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（Orthogonal experimental design）是研究多因素多水平的一種設(shè)計(jì)方法。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)多用于培養(yǎng)條件的優(yōu)化，如Qingmiao等［27］采用正交試驗(yàn)對(duì)E2降解菌降解條件進(jìn)行優(yōu)化，針對(duì)低溫萘降解菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化，目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究在低溫萘降解菌單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中萘濃度、培養(yǎng)溫度、初始pH、培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)、培養(yǎng)時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行方差分析。正交試驗(yàn)結(jié)果與單因素試驗(yàn)結(jié)果存在差異，因各因素之間存在著交互作用，正交試驗(yàn)結(jié)果更具有說(shuō)服力，利用正交設(shè)計(jì)篩選組合結(jié)果可靠，方法可行。同時(shí)降解菌株的生長(zhǎng)與五因素均有顯著關(guān)系，利用正交試驗(yàn)分析影響萘降解的主控因素，在實(shí)際土壤萘污染治理過(guò)程中，依據(jù)環(huán)境因素，合理選擇菌株并優(yōu)化調(diào)控手段實(shí)現(xiàn)土壤萘污染高效修復(fù)。

4 結(jié)論

（1）從黑龍江省大慶油田地區(qū)污染土壤篩選出2株在低溫條件下高效降解萘的菌株，編號(hào)為GN1和GN2。在對(duì)照組非生物因素影響基礎(chǔ)上，萘（300 mg/L）的降解率在4 d內(nèi)達(dá)到94.43%和95.47%，顯示出在低溫條件下較強(qiáng)降解萘的能力。（2）菌株GN1和GN2經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA基因序列鑒定皆屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）。（3）菌株GN1和GN2的最佳培養(yǎng)條件均為：萘-無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（萘濃度300 mg/L），培養(yǎng)溫度15℃，初始pH 6.0，培養(yǎng)轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間7 d，去除率分別達(dá)到99.1%和99.8%。（4）菌株的生長(zhǎng)與五因素均有顯著關(guān)系。在實(shí)際土壤萘污染治理過(guò)程中，依據(jù)菌株降解最適條件，優(yōu)化調(diào)控手段實(shí)現(xiàn)土壤萘污染高效修復(fù)。