富硒青錢柳蟲草片降血糖、免疫調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究

李東山 呂 萌 譚開祥 向極釬 劉 衛(wèi)*

（1 華中科技大學(xué)，湖北 武漢 430074；2 湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；3 恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445099）

青錢柳（Cyclocarya paliurus（Batal） Ijinskaja），為我國特有的單種屬植物，早有古籍記載其枝葉具有清熱解毒等功效，民間多將其制成茶葉飲用。目前已有大量研究表明青錢柳具有降血糖、降血脂等功效[1-4]。硒是一種人體重要的微量元素。研究表明，硒具有提高人體抗氧化能力和改善免疫力等功效，適量補(bǔ)硒對于糖尿病的預(yù)防與治療具有重要意義[5-8]。有研究表明硒可以與青錢柳多糖結(jié)合形成硒多糖，且具有更好的降血糖作用[9]。發(fā)酵蟲草菌粉是通過分離天然蟲草菌株，進(jìn)行深層發(fā)酵得到的。已有文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)酵蟲草菌粉與冬蟲夏草具有相同的功效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤等多種功效[10-11]。我們采用恩施富硒青錢柳提取物復(fù)配發(fā)酵蟲草菌粉、枸杞提取物和茯苓提取物等功效成分制成壓片，旨在用富硒青錢柳提取物復(fù)配以蟲草菌粉為主的天然藥物活性成分能夠增強(qiáng)降血糖效果，并且提高藥物服用順應(yīng)性。本文主要探討富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠血糖、抗氧化和免疫力的影響，為富硒青錢柳蟲草片的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 材料：富硒青錢柳葉由湖北恩施思慧生物科技有限公司提供，75℃蒸餾水提取2 h濃縮冷凍干燥得富硒青錢柳提取物。發(fā)酵蟲草菌粉、枸杞提取物、茯苓提取物購于杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司。富硒青錢柳蟲草片規(guī)格為0.6克/片，根據(jù)相關(guān)專利設(shè)計(jì)配方[12]，主要成分為：富硒青錢柳提取物、發(fā)酵蟲草菌粉、枸杞提取物、茯苓提取物、輔料。片劑中硒含量為79.4 μg/g，腺苷含量為895 μg/g。

1.2 動物：4周齡，SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠 65只，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：42000600020649。普通維持料及高脂飼料由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 試劑和儀器：消渴丸（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司）；鏈脲佐菌霉素（阿拉丁試劑）；羅康全活力型血糖試紙（羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

血糖儀（羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）；318C 酶標(biāo)儀（成都華衡儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥：參考文獻(xiàn)方法[9,13]，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，禁食過夜后測定小鼠空腹血糖值，按照空腹血糖隨機(jī)分組。設(shè)置空白組（灌胃生理鹽水）、模型組（灌胃生理鹽水）、富硒青錢柳蟲草片低、中、高劑量組（給藥劑量根據(jù)人體推薦劑量換算得到，分別為0.185 g/kg、0.370 g/kg、0.740 g/kg），小鼠給藥劑量與人體推薦量換算參照文獻(xiàn)方法[14]，陽藥組（0.514 g/kg 消渴丸）作為陽性對照。分組后各組小鼠均為10只。實(shí)驗(yàn)期間，空白組給普通飼料，其他各組給高脂飼料喂養(yǎng)。連續(xù)給藥42 d。

2.2 高血糖小鼠模型建立：參考文獻(xiàn)[13,15]，小鼠腹腔注射STZ溶液（以0.1 mol/L檸檬酸緩沖鹽溶液作為STZ 溶劑）損傷胰島細(xì)胞，聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)建立高血糖小鼠模型。實(shí)驗(yàn)小鼠連續(xù)給藥2周后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量腹腔注射40 mg/kg STZ 溶液，空白組腹腔注射溶劑。3 d 后，以同樣的步驟重復(fù)注射STZ溶液。

2.3 血糖與糖耐量的測定：末次給藥后，尾尖取血測小鼠血糖并計(jì)算糖耐量（oral glucose tolerance test，OGTT）。小鼠禁食過夜，尾尖取血，測空腹血糖作為0 h血糖值。之后按體質(zhì)量灌胃2.5 g/kg 的葡萄糖溶液，測量灌胃葡萄糖溶液后0.5 h、1 h、2 h的小鼠血糖，并計(jì)算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）[16]。

2.4 血清指標(biāo)的測定：糖耐量試驗(yàn)后，全部老鼠換為普通飼料喂養(yǎng)。2 d后禁食過夜，摘眼球取血。全血離心分離血清，使用試劑盒測定血清中SOD、GSH-Px活力。

2.5 免疫器官指數(shù)的檢測：所有小鼠取血前稱取體質(zhì)量，取血后將小鼠脫臼處死。解剖摘取脾臟記重，并計(jì)算臟器指數(shù)[17]。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析：使用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間多重比較采用LSD法。

3 結(jié)果與分析

3.1 富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠糖耐量的影響：末次給藥后測得小鼠血糖值并計(jì)算糖耐量，結(jié)果見表1。

由表1可知，糖耐量實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠AUC顯著高于空白組（P＜0.01），證明糖尿病小鼠模型建立成功。相較于模型組，富硒青錢柳蟲草片中、高劑量組和陽藥組都具有顯著降低血糖的效果（P＜0.05）。并且富硒青錢柳蟲草片中、高劑量降血糖效果與陽藥消渴丸相當(dāng)。低劑量組有下降趨勢，但無顯著性差異。

3.2 富硒青錢柳蟲草片對小鼠血清中GSH-Px、SOD活力的影響：SOD、GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中最重要的酶，在機(jī)體抗自由基損傷中起重要作用。連續(xù)給藥42d后，測定小鼠血清中GSH-Px、SOD活力。結(jié)果見圖1。如圖1所示，相比于空白組，其他各組SOD活力都有一定程度的降低，表明造模后小鼠血清SOD活力降低，陽藥消渴丸與富硒青錢柳蟲草片對SOD活力都無明顯改善效果。GSH-Px 檢測結(jié)果中，陽藥組和高劑量組GSH-Px活力相較于模型組也顯著升高（P＜0.05），且高劑量組效果優(yōu)于陽藥組。同時富硒青錢柳蟲草片低劑量組、高劑量組和陽藥組GSH-Px活力相較于空白組都有顯著升高（P＜0.05）。

表 1 小鼠血糖和 AUC （x-±s）

圖1 小鼠血清 SOD 和 GSH-Px 活力測定結(jié)果比較

3.3 富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠免疫器官指數(shù)的影響：脾臟是動物體內(nèi)重要的免疫器官，在脾臟中棲居著大量淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞，脾臟指數(shù)在一定程度上能反映小鼠免疫功能的高低[17]。

圖2 小鼠免疫器官指數(shù)測定結(jié)果比較

如圖2 所示，陽藥組、中劑量組和高劑量組脾臟指數(shù)相較于空白組脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.01或P＜0.05），且富硒青錢柳蟲草片提升糖尿病小鼠脾臟指數(shù)具有劑量效應(yīng)。

4 結(jié)果與討論

糖尿病是一種由多病因引發(fā)的慢性內(nèi)分泌代謝紊亂綜合征，糖尿病患者一般伴隨有免疫力低下，并患有各種并發(fā)癥。本文研制的富硒青錢柳蟲草片旨在發(fā)揮青錢柳降血糖效果的同時，結(jié)合微量元素硒和蟲草菌粉、枸杞和茯苓免疫力調(diào)節(jié)、抗氧化的作用，達(dá)到更好的降血糖、緩解糖尿病患者并發(fā)癥的效果。同時，片劑方便患者服用，利于提高服藥順應(yīng)性。

本文通過腹腔注射STZ，以及長期喂養(yǎng)小鼠高脂飼料誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型，連續(xù)給藥42 d對富硒青錢柳蟲草片進(jìn)行功效評價(jià)。小鼠糖耐量試驗(yàn)結(jié)果，顯示中劑量組、高劑量組具有顯著降血糖的效果。表明富硒青錢柳蟲草片具有顯著的降低糖尿病小鼠血糖的功效。

SOD、GSH-Px是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示造模后糖尿病小鼠SOD活力降低，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明富硒青錢柳蟲草片對糖尿病小鼠SOD活力無明顯改善效果。GSH-Px測定結(jié)果表明富硒青錢柳蟲草片可有效提高糖尿病小鼠GSH-Px 活力，其中高劑量組效果最為顯著。免疫器官脾臟指數(shù)實(shí)驗(yàn)中，測定結(jié)果表明富硒青錢柳蟲草片高劑量組具有明顯的提高臟器指數(shù)的功效，其作用機(jī)制還有待深入研究。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富硒青錢柳蟲草片在降低糖尿病小鼠血糖的同時，具有一定的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功效。