醛糖還原酶抑制劑對屋塵螨誘導的人支氣管上皮細胞炎癥因子的影響*

林玫，甄海寧，何芳，丁敏，陳亞雋，袁竹青，薛欣欣，鮑敏

[武漢大學附屬同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院） 呼吸內(nèi)科，湖北 武漢 430060]

目前抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor, NFκB）的活性已成為治療哮喘氣道炎癥的新靶點。醛糖還原酶（aldose reductase, AR）受到環(huán)境中的炎癥刺激后，表達明顯升高，繼而轉(zhuǎn)錄因子NF-κB被激活，其下游炎癥介質(zhì)釋放，促進炎癥的病理過程[1]。醛糖還原酶抑制劑（aldose reductase inhibitors, ARI）可以阻斷依賴NF-κB的炎癥信號，提示ARI對炎癥反應有調(diào)控作用[2]。但屋塵螨誘導氣道炎癥的影響研究甚少。為此，筆者擬探討ARI對屋塵螨誘導的氣道上皮細胞炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器Hettich UNIVERSAL 32R臺式離心機（德國Eppendorf公司），微量加樣器、微量加樣管均購自德國Eppendorf公司，垂直流超凈工作臺（上海智城分析儀器制造有限公司），恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱（上海姚氏儀器設備廠），熱循環(huán)儀（德國Eppendorf公司），酶標儀（德國Satorius公司），Nandrop分光光度計（德國Eppendorf公司），恒溫搖床（美國New Brunswich Scientific公司），蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.2 主要試劑健康人支氣管上皮細胞16-HBE（武漢大風生物科技有限公司），RPMI 1640培養(yǎng)液（美國Invitrogen公司）、胎牛血清（美國Invitrogen公司），屋塵螨抗原（Horsholm，Denmark，丹麥ALK公司），焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）（廣州索沃生物技術(shù)公司），RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司），逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV-RT）、引物均購自上海英駿生物工程有限公司，PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），ELISA試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司），核蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技有限公司），醛糖還原酶抑制劑唑泊司他（Zopolrestat）（美國Pfizer 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)將復蘇后的16-HBE細胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含12%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，置培養(yǎng)瓶于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，每日更換培養(yǎng)液。倒置顯微鏡下可見細胞呈不規(guī)則多邊形，待90%培養(yǎng)瓶底被細胞呈鵝卵石樣鋪滿后，進行傳代培養(yǎng)。換液1次/d，約2 d后傳代。按l∶2～1∶4的比例將其分瓶傳代培養(yǎng)。當細胞融合至90%～95%后，將細胞消化，并用細胞計數(shù)板計數(shù)，傳至6孔平底細胞培養(yǎng)板，每孔加入密度為2×105個/ml的細胞懸液2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，建立細胞模型及相關實驗。

1.2.2 細胞分組培養(yǎng)板中的細胞分為空白對照組、屋塵螨組、屋塵螨+Zopol組和Zopol組，每組分別置于12個培養(yǎng)孔中培養(yǎng)。選擇既不影響細胞活性，也有顯著抑制效應的濃度，屋塵螨+Zopol組以50μmol/L 的濃度加入Zopol，并加入屋塵螨共同培養(yǎng)24 h；Zopol組以50μmol/L的濃度加入Zopol，但不加入屋塵螨；空白對照組不加入刺激物，培養(yǎng)24 h。屋塵螨組加入屋塵螨刺激，培養(yǎng)24 h。

1.2.3 提取核蛋白收集細胞，棄掉培養(yǎng)液，以預冷的磷酸鹽緩沖溶液洗滌2遍；用移液槍吸去上清液；每毫升Buffer A中加入5μl 100 mmol/L PMSF、1μl蛋白酶抑制劑、1μl二硫蘇糖醇，根據(jù)細胞壓積，按體積比行細胞壓積∶Buffer A為1.0∶1.5，加入上述準備好的預冷的150μl Buffer A，以最大轉(zhuǎn)速進行渦旋劇烈振蕩15 s，并置于冰上10 min；加入12.5μl Buffer B，快速震蕩混勻，放置冰上1 min后，于4℃、16 000 r/min離心30 s。收集上清至新的離心管。于每毫升Buffer C中加入1μl蛋白酶抑制劑、5μl 100 mmol/L PMSF、1μl二硫蘇糖醇，在離心沉淀物中加入上述準備好的預冷的100μl Buffer C，以最大轉(zhuǎn)速進行渦旋劇烈振蕩15 s，并置于冰上30 min，每間隔10 min進行渦旋劇烈振蕩15 s；4℃、16 000 r/min離心10 min，把上清轉(zhuǎn)入預冷的離心管；以考馬斯亮藍G-250染料，進行蛋白濃度測定，并保存于-80℃，應避免反復凍融。

1.2.4 Western blotting取出聚丙烯酰胺凝膠電泳，裝入電泳槽，再加入電泳緩沖液；將蛋白樣品與5×十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠加樣緩沖液相混合，再按照上樣順序進行點樣，使樣本濃度及體積保持一致；對應正負極蓋上蓋子，紅對紅，黑對黑，將電壓調(diào)整至80 V，進行電泳；氣泡出現(xiàn)指示電泳開始，待蛋白樣品電泳至下層分離膠時暫停電泳，將電壓調(diào)至120 V繼續(xù)電泳；等溴酚藍電泳到分離膠底部時，停止電泳。將裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride, PVDF）泡入甲醇中待用；在容器中倒入預冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，將轉(zhuǎn)膜夾和海綿完全浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，并將濾紙和用甲醇活化的PVDF膜一起放入轉(zhuǎn)膜液中10 min；取出電泳完的凝膠玻璃板，切割目的蛋白所在區(qū)域凝膠；將目的蛋白凝膠置于濾紙上，并用轉(zhuǎn)膜液潤濕，將PVDF膜置于凝膠之上，趕出氣泡，蓋上濾紙，防止引入氣泡；合上轉(zhuǎn)膜夾，將轉(zhuǎn)膜夾對應正負極放入轉(zhuǎn)膜槽，電極方向為膜正膠負，使夾的黑面對著槽的黑面，且夾的白面對著槽的紅面；放入冰盒，灌滿轉(zhuǎn)膜液，對應正負極蓋上蓋子，于200 mA進行轉(zhuǎn)膜60 min。在室溫下將PVDF膜正面朝上放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液，搖床上封閉孵育1 h；把一抗（兔抗小鼠NF-κB/p65多克隆抗體，兔抗小鼠Histone H3抗體）以含0.5%脫脂奶粉的TBST抗體稀釋液按1∶1 000稀釋；取出膜并放于已經(jīng)加好一抗的小塑料袋中；室溫下把膜置于搖床上一抗孵育1 h；取出膜，TBST溶液中洗滌，每次10 min，重復漂洗3次。用抗體稀釋液以1∶6 000稀釋二抗（辣根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白G）， 把膜移到已經(jīng)加好二抗溶液的小塑料袋中，于室溫、搖床上二抗孵育1 h；取出膜并用TBST溶液洗滌 3次，每次10 min。經(jīng)過顯影、定影，將圖像輸入電腦，應用圖像分析軟件對Western blotting檢測結(jié)果進行分析，以Histone H3蛋白作為對照，各組中NF-κB/p65蛋白的面積灰度值與Histone H3蛋白的比值即表達 強度。

1.2.5 提取細胞總RNA吸去各6孔板中的細胞培養(yǎng)液，然后在每孔中加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，使其充分裂解，收集至去RNA酶的1.5 ml EP管中；12 000 r/min離心5 min，棄去沉淀；加入氯仿0.2 ml，震蕩15 s，靜置于室溫15 min；4℃、12 000 r/min離心15 min；將上層水相轉(zhuǎn)至另一EP管中，加入異丙醇0.5 ml，顛倒混勻，室溫下靜置10 min；于4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，RNA沉淀沉于管底；加入75%乙醇lml（用0.1% DEPC水配置），震蕩混勻；4℃、8 000r/min離心5 min，棄上清，于室溫下自然風干RNA沉淀5～10 min，不要讓RNA過度干燥；加DEPC水40μl，置60℃水浴箱5 min，使RNA溶解。在Nandrop分光光度計上測定RNA濃度和 純度。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄將RNA模板、引物、dNTPmix、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RT Buffer及RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。根據(jù)以下配比配制反應體系：dNTPmix 4μl、Primer 2μl、RNA模板2μg、5×RT Buffer 4μl、RNA酶抑制劑2μl、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl及RNase-Free Water補充反應體積至20μl。渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育50 min，72℃孵育5 min，反應結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻，置于-20℃條件下保存。

1.2.7 實時熒光定量PCRPCR反應體系：2×Ultra SYBR Mixture（TaqDNA聚合酶和dNTPs）10μl，正向引物（10μmol/L）0.4μl，反向引物（10μmol/L）0.4μl，DNA模板0.8μl，RNase-Free Water 8.4μl，總體積20μl。反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，后2步重復40個循環(huán)；熔解曲線分析程序：95℃ 15 s，61℃ 55 s，95℃ 15 s。NF-κB/p65正向引物：5’-ATGTGGAGATCATTGAGCAGC-3’，反向引物：5'-CCTGGTCCTGTGTAGCCATT-3'。反應結(jié)束后用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性，排除引物二聚體的存在。將目的基因Ct值用GAPDH的Ct值標準化，用2-△△Ct表示基因表達的相對量。△△Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）實驗組-（Ct目的基因一Ct內(nèi)參基因）對照組。為進一步觀察產(chǎn)物的表達情況，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠 電泳。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-1inked immunosorbent assay, ELISA）以ELISA檢測細胞上清液中IL-29、IL-6的濃度。配制好不同濃度IL-29/IL-6的標準品，加50μl待測的細胞上清液或標準品于酶標板上，每孔加入50μl抗IL-29/IL-6抗體，使之震蕩混勻；酶標板于37℃孵育2 h；洗滌4次；每孔加入100μl酶標試劑，于室溫孵育30 min；洗滌4次；每孔加入100μl底物顯色液，于室溫下，避光孵育30 min后顯色；加入100μl終止反應液，將反應板置于多功能酶標儀中，測定各孔于450 nm波長處的光密度值，并計算其濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學 意義。

2 結(jié)果

2.1 各組NF-κB/p65 mRNA相對表達量比較

各組NF-κB/p65 mRNA相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =160.580，P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對照組NFκB/p65 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1和圖1。

2.2 各組NF-κB/p65蛋白相對表達量比較

各組NF-κB/p65蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =229.181，P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對照組NF-κB/p65蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組細胞NF-κB/p65 mRNA相對表達量比較

表1 各組細胞NF-κB/p65相對表達量比較 （n =12，±s）

表1 各組細胞NF-κB/p65相對表達量比較 （n =12，±s）

組別NF-κB/p65 mRNANF-κB/p65蛋白空白對照組1.110±0.2110.271±0.043屋塵螨組3.243±0.3821.125±0.145屋塵螨+Zopol組2.016±0.258 0.658±0.098 Zopol組1.105±0.218 0.265±0.042

圖2 各組細胞NF-κB/p65核蛋白相對表達量比較

2.3 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較

各組細胞上清液的IL-6、IL-29蛋白水平的比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F =169.729和118.681，均P =0.000）；屋塵螨+Zopol組低于屋塵螨組（P ＜0.05），但高于空白對照組（P ＜0.05），Zopol組與空白對照組IL-6蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2和 圖3。

表2 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較 （n =12，pg/ml，±s）

表2 各組IL-6、IL-29蛋白水平比較 （n =12，pg/ml，±s）

組別IL-6IL-29空白對照組103.916±15.85955.083±13.534屋塵螨組300.000 ±37.033158.833±20.630屋塵螨+Zopol組201.000±25.193103.475±12.409 Zopol組102.791±15.66454.166±15.278

圖3 各組細胞上清液IL-6、IL-29蛋白水平比較 （±s）

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)ARI可抑制細胞因子、生長因子、高血糖、LPS誘導的細胞毒信號及炎癥標志物的表 達[3-4]。ARI可抑制某些過敏原誘導的小鼠哮喘模型的氣道炎癥，進一步肯定了ARI的抗炎作用。AR基因敲除的大鼠可耐受變應原，在很大程度上減輕了變應原誘導的肺部炎癥改變[5]。丙烯醛是一種重要的內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。有研究結(jié)果表明，ARI可以抑制丙烯醛誘導的肺泡上皮細胞的細胞毒性[6]。

有研究發(fā)現(xiàn)，ARI可阻止心瓣膜術(shù)后再狹窄、糖尿病并發(fā)癥及動物模型動脈硬化的發(fā)生[7-8]。還有研究顯示，ARI通過防止DOX誘導的內(nèi)皮細胞毒性和功能障礙，避免了與蒽環(huán)類化療相關的心臟毒性[9]。AR還參與多種炎癥疾病的病理過程，因此ARI也可能作為抗炎藥物而得到發(fā)展。

過去的研究顯示，在某些動物和細胞模型中，ARI可以調(diào)控NF-κB介導的炎癥信號；并觀察到AR藥物抑制劑或基因敲除，防止了小氣道上皮細胞的凋亡及活性氧的增殖、炎癥標志物的分泌、NF-κB的激活[10]。有研究提示依賴ARI的NF-κB的失活，減少了一些炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達[11]。AR可以介導過敏原誘導的氣道重塑。AR抑制劑非達司他可以通過抑制TGFβ1誘導的Smad非依賴性和PI3K/AKT/GSK3β依賴性途徑，而阻斷這個氣道重塑過程[12]。

本實驗結(jié)果顯示，屋塵螨+Zopol組經(jīng)屋塵螨及ARI唑泊司他共同作用24 h后，人支氣管上皮細胞的NF-κB/p65 mRNA水平、NF-κB/p65蛋白水平、IL-6及IL-29蛋白水平均低于屋塵螨組。ARI唑泊司他可降低人支氣管上皮細胞NF-κB/p65的表達，并可能通過抑制NF-κB介導的炎癥信號通路，而減少炎癥因子IL-6和IL-29的表達。

有研究顯示，ARI明顯地減輕了氣道高反應性、免疫球蛋白E的水平，嗜酸性細胞的浸潤，以及氣道Th2細胞因子的釋放[13-14]，另外，也有實驗顯示，經(jīng)卵清蛋白刺激的小鼠，其氣道炎癥細胞的遷移及炎癥細胞因子、趨化因子、杯狀細胞化生、膠原沉積及氣道高反應性可以被ARI抑制，提示ARI可能提供一個新的治療途徑應對哮喘這類氣道炎癥疾病。ARI非達司他處理的小鼠，接觸過敏原后如鼻劃痕，肥大細胞脫顆粒，在鼻通道釋放類胰蛋白酶等的早期反應，與對照組比較，明顯減弱，且后期反應如炎癥細胞浸潤、Th2型細胞因子的釋放、鼻上皮重塑等均明顯減弱，提示了ARI對過敏性鼻炎的療效[15]。

綜上所述，唑泊司他調(diào)控了屋塵螨誘導的NF-κB介導的炎癥信號，明顯地抑制了氣道上皮NF-κB的表達及其下游炎癥因子的表達，深入研究ARI，可能為屋塵螨引起的氣道炎癥的治療提供新的方向。