高CO2濃度下外源糖對‘黑比諾’葡萄試管苗生長及光合特性的影響

金曉雲(yún)，趙鑫，蘇艷麗，劉伊騏，馮致*，毛娟*（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

葡萄為多年生藤本漿果類果，有著悠久的種植歷史。‘黑比諾’作為重要的酒用品種，其果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響到葡萄酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。而植物組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種方便快捷的培養(yǎng)技術(shù)，現(xiàn)已應(yīng)用于藥用植物[1]、花卉[2]、果樹[3]、草業(yè)[4]和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5]等多個(gè)領(lǐng)域中并日趨發(fā)展成熟。在試管苗組織培養(yǎng)當(dāng)中，外源糖可以作為碳源來維持植株正常生長發(fā)育，CO2的濃度也會影響到試管苗的生長發(fā)育。故研究外源糖以及高CO2濃度對葡萄試管苗的影響對進(jìn)一步研究試管苗糖代謝以及CO2對試管苗生長的影響有著重要的意義。

外界條件能夠影響葡萄試管苗的生長。研究發(fā)現(xiàn)，外源糖種類的不同會影響試管苗相關(guān)酶活性的表達(dá)，糖代謝相關(guān)酶活性在試管苗生長發(fā)育過程中表現(xiàn)出差異顯著性，并且ZT、IAA、ABA含量在不同糖處理間均表現(xiàn)出一定的差異顯著性[6-9]，糖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)也參與了植物根離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的調(diào)控[10]。糖還會誘導(dǎo)激素的產(chǎn)生，影響激素的生物合成[11]。糖也在植物生長發(fā)育、代謝調(diào)控及抵抗脅迫等方面具有重要調(diào)節(jié)作用，糖作為信號分子參與調(diào)控低溫脅迫[12]。而CO2濃度的升高可以增加紅樺可溶性蛋白的總量，改變可溶性蛋白的分配模式[13]。高濃度CO2條件下的香蕉葉片光合速率明顯高于低濃度CO2條件下的葉片光合速率[14]。另外，CO2濃度的升高有可能影響到了光合作用以及氮同化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。培養(yǎng)基糖種類及CO2濃度的變化與植株的生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、可溶性蛋白含量等相關(guān)。

外源糖與CO2濃度在植物生長各環(huán)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，但高CO2濃度下不同糖種類對葡萄試管苗如何影響試管苗的生長發(fā)育、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、可溶性蛋白質(zhì)含量方面影響的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。因此，本文以‘黑比諾’葡萄試管苗為材料，研究相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)而分析高CO2濃度下外源糖種類的不同對葡萄試管苗生長發(fā)育及光合能力的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用材料‘黑比諾’（Pinot Noir）試管苗來自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院試驗(yàn)室。以GS為基本培養(yǎng)基，分別加入蔗糖、葡萄糖、果糖各20 g/L作為3個(gè)糖源處理；正常CO2環(huán)境濃度（380±40）μmol/mol，3個(gè)糖源處理分別命名為S、G、F；高CO2環(huán)境（1000 μmol/mol）3個(gè)糖源處理分別命名為S1、G1、F1。轉(zhuǎn)接‘黑比諾’試管苗單芽莖段，轉(zhuǎn)接后放入PQX-430D人工氣候箱27 ℃、16 h光照/8 h黑暗進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度120 μmol/(m2·s)。高CO2處理PQX-430D人工氣候箱加裝CO2控制模塊。每7 d觀察一次，待生根后每3 d觀察一次。轉(zhuǎn)接第25天后測定試管苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)、可溶性蛋白含量以及葉綠素相對含量。

1.2 測定方法

可溶性蛋白質(zhì)測定：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定‘黑比諾’樣品中可溶性蛋白含量。

葉綠素相對含量測定：葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素儀測定。利用SPAD-502葉綠素儀測定葉片的前中后3個(gè)不同的位置，計(jì)算其平均值，進(jìn)行3次重復(fù)。

葉綠素?zé)晒猓簩ⅰ诒戎Z’幼苗暗適應(yīng)30 min，對充分展開的第3、4片功能葉利用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（MAXI Imaging-PAM, Walz, Effeltrich, Germany）進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入以及數(shù)據(jù)圖表的制作。采用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高CO2濃度下不同糖種類對試管苗愈傷組織的影響

如圖1，正常條件G處理在轉(zhuǎn)接9 d后大量出現(xiàn)愈傷組織，18 d后出愈率達(dá)98%。轉(zhuǎn)接9 d后S處理試管苗70%出現(xiàn)愈傷組織，轉(zhuǎn)接21 d時(shí)，出愈率達(dá)95%。轉(zhuǎn)接9 d時(shí)F處理出愈率僅為51%，轉(zhuǎn)接后9～15 d，大量產(chǎn)生愈傷組織，第21天后愈傷組織誘導(dǎo)率為95%。高CO2條件下轉(zhuǎn)接試管苗9 d后，G1處理試管苗出愈率達(dá)85%，在第21天后全部處理出現(xiàn)愈傷組織。S1轉(zhuǎn)接第9天時(shí)，78%出現(xiàn)愈傷組織，在轉(zhuǎn)接后12～18 d愈傷組織生長迅速，18 d后趨于平穩(wěn)。F1在9 d后出愈率為64%，9～15 d后愈傷組織生長大幅增長，18 d后生長速度趨于平穩(wěn)。總體表現(xiàn)為：相同環(huán)境下，蔗糖處理對植株愈傷組織生長前期的促進(jìn)作用最為顯著。同種糖處理下，高CO2濃度在試管苗轉(zhuǎn)接后能夠促進(jìn)愈傷組織的生長，但在生長后期與正常CO2濃度處理愈傷組織生長趨于一致。

圖1 不同外源糖及CO2濃度處理對試管苗愈傷組織的影響Figure 1 Changes of different sugars and different concentration of CO2 on callus in vitro

2.2 高CO2濃度下不同糖類對試管苗生根的影響

高CO2環(huán)境下葡萄糖處理平均根長增加最為顯著，較其他兩種處理平均根長分別增長0.54 cm、1.02 cm。高CO2環(huán)境下G、S與F三個(gè)處理試管苗前30 d根長高于正常CO2濃度。正常處理平均根長為3.4 cm，高CO2處理平均根長為2.7cm。但在生長后期，高CO2濃度處理植株生長速度減緩，6個(gè)處理根長并無顯著差異（圖2）。

圖2 不同外源糖及CO2濃度處理下試管苗根長的變化Figure 2 Changes of different sugars and different concentration of carbon dioxide on root length in vitro

2.3 高CO2濃度下不同糖種類對試管苗株高的影響

高CO2濃度下18～24 d株高平均生長速度加快，平均值較正常處理分別增加2.33 cm、1.20 cm、1.00 cm。外源增施葡萄糖對植株生長促進(jìn)作用明顯（圖3）。

圖3 不同外源糖處理及CO2濃度對試管苗株高的影響Figure 3 Effects of different sugars and different concentration of carbon dioxide on plant height in vitro

2.4 高CO2濃度下不同外源糖種類對試管苗可溶性蛋白質(zhì)及葉綠素含量的影響

高CO2濃度處理下，G1與S1處理試管苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于F1處理，G1與S1可溶性蛋白含量無顯著性差異（圖4-A）。正常CO2濃度下F葉綠素含量分別高出其他兩種處理6.09、4.63。3種處理葉綠素相對含量由低到高依次為G、S、F。G1與S1葉綠素含量幾乎一致，由此可以看出，不同糖類處理的植株對CO2濃度反應(yīng)不同。果糖處理植株葉片的葉綠素相對含量對CO2濃度的變化反應(yīng)更為明顯。高CO2濃度對果糖處理植株葉綠素合成表現(xiàn)出抑制作用，從而使得葉綠素相對含量下降（圖4-B）。

圖4 不同外源糖及CO2濃度處理下試管苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量和葉綠素含量Figure 4 Soluble protein content and chlorophyll content of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

2.5 高CO2濃度下不同外源糖種類對試管苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

高CO2濃度下，G1處理試管苗葉片電子傳遞速率大于其他兩處理（圖5-A）。正常條件不同糖處理試管苗葉片實(shí)際光量子產(chǎn)量（ΦPSII）從高到低依次為：G＞S＞F。高CO2下，蔗糖與果糖處理試管苗葉片ΦPSII均高于正常處理，而葡萄糖處理下葉片ΦPSII相比正常處理下降（圖5-B）。正常CO2條件下非光化學(xué)淬滅系數(shù)（NPQ）三種糖處理無顯著差異。高CO2三種糖處理NPQ顯著低于正常CO2處理，其中G1處理顯著低于其他處理（圖5-C）。葉片最大量子產(chǎn)量（Fv/Fm）在正常CO2處理下無顯著差異。在高濃度CO2的三種糖處理的Fv/Fm均高于正常CO2處理，其中S1與F1相比G1處理顯著升高（圖5-D）。

圖5 不同外源糖處理及CO2濃度對試管苗葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)的變化Figure 5 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of different sugars and different concentration of CO2 in vitro

3 討論與結(jié)論

植物組織培養(yǎng)中主要以蔗糖作為碳源。但不同植物對不同糖類的反應(yīng)不完全相同[16]。蔗糖被植物吸收后被分解為己糖，蔗糖通過蔗糖合成酶（SS）催化生成果糖，經(jīng)轉(zhuǎn)化酶（IVR）水解生成果糖與葡萄糖[17]；而酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）將會催化蔗糖不可逆分解為果糖和葡萄糖[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在高濃度CO2下，葡萄糖對單芽莖段愈傷組織的形成有明顯促進(jìn)作用，而果糖對試管苗愈傷組織的形成促進(jìn)作用較弱。

葡萄糖作為信號分子，通過糖酵解和線粒體磷酸化來調(diào)控葉片光合作用，促進(jìn)根分生組織活性[19]。葡萄糖對試管苗根的生長有明顯的促進(jìn)作用，這與前人的研究相一致，并且外源葡萄糖可以增加植株側(cè)根以及根毛數(shù)量[19-20]。葡萄糖可以通過糖酵解和線粒體生物能傳遞，驅(qū)動TOR信號傳導(dǎo)，從而快速控制根分生組織代謝轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，活化細(xì)胞周期，進(jìn)而促進(jìn)根分生組織激活[21]。高CO2濃度下不同糖源對植株根系生長速度的影響表現(xiàn)出顯著差異。

本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明高濃度CO2還引起了不同糖源影響植株的實(shí)際光量子產(chǎn)量差異性表達(dá)。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在植株生長初期高CO2濃度處理促進(jìn)試管苗生長，其長勢明顯優(yōu)于正常處理植株，而在生長后期，CO2處理不再表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。這可能是高CO2濃度負(fù)反饋調(diào)節(jié)呼吸代謝有關(guān)[22]，或者是因?yàn)橹仓陮Ω逤O2濃度環(huán)境產(chǎn)生了光和適應(yīng)。而本試驗(yàn)未涉及高CO2濃度對酸性轉(zhuǎn)化酶等相關(guān)酶對蔗糖分解速率的研究，這有待進(jìn)一步探索。

葉片中可溶性蛋白含量的高低可以反映不同處理植株的氮素代謝水平。葉片中所含的可溶性蛋白主要包括以RuBp羧化酶為主的可溶性蛋白，參與卡爾文循環(huán)的相關(guān)酶，以及位于葉綠體類囊體膜上含有色素蛋白復(fù)合體的相關(guān)蛋白[13]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高CO2濃度環(huán)境中，蔗糖處理可溶性蛋白含量最高，這可能是由于CO2濃度的增加影響到了蔗糖的不可逆分解進(jìn)程。

試驗(yàn)通過統(tǒng)計(jì)第25天試管苗葉片葉綠素相對含量發(fā)現(xiàn)，果糖處理中葉綠素相對含量較高，說明果糖對植株葉片葉綠素的合成起到明顯促進(jìn)作用。這說明外界CO2濃度影響到了不同糖在試管苗體內(nèi)的代謝進(jìn)程。

Fv/Fm可以反映PSII反應(yīng)中心潛在光能轉(zhuǎn)化效率，即PSII反應(yīng)中心均處于開放狀態(tài)時(shí)的量子產(chǎn)量。ΦPSII即線性電子傳遞的量子效率，也是PSII實(shí)際的電子傳遞的量子效率，其值用來反映電子在PSII與PSI的傳遞情況[23]。當(dāng)PSII反應(yīng)中心天線色素吸收了過量的光能時(shí)，如不能及時(shí)地耗散將對光合機(jī)構(gòu)造成失活或破壞，所以非光化學(xué)淬滅是一種自我保護(hù)機(jī)制，對光合機(jī)構(gòu)起一定的保護(hù)作用[24]。正常CO2條件三種糖處理NPQ應(yīng)高于高CO2處理，說明高CO2能夠促進(jìn)PSII反應(yīng)中心吸收光能，降低過剩光能對光系統(tǒng)的破壞。根據(jù)彭長連等[25]的研究，高CO2濃度能夠提高PSII光化學(xué)活性，并且促進(jìn)PSII電子傳遞的相對量子產(chǎn)量。增加葉綠素?zé)晒夤饣瘜W(xué)淬滅組分，降低非光化學(xué)猝滅組分。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高CO2濃度下，葡萄糖處理電子傳遞量子效率實(shí)際光化學(xué)產(chǎn)量均低于其他兩種處理并表現(xiàn)出顯著差異。而其非光化學(xué)淬滅系數(shù)也低于其他兩種處理。說明葡萄糖處理對所吸收的過量光能的耗散能力較差，導(dǎo)致其光合機(jī)制被破壞，從而造成了其光化學(xué)效率降低。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，葡萄糖對單芽莖段愈傷組織的形成有明顯促進(jìn)作用，而果糖對試管苗愈傷組織的形成促進(jìn)作用較弱。同時(shí)表明，葡萄糖對試管苗根的生長有明顯的促進(jìn)作用。糖種類的不同還影響了植物體內(nèi)不同糖的轉(zhuǎn)化速率以及相關(guān)糖轉(zhuǎn)化酶的活性。

不同CO2濃度對植株根系的生長速度表現(xiàn)出顯著差異。高CO2濃度可以刺激植株快速生長，并直接影響到植物光合作用效果。而本試驗(yàn)中未涉及CO2濃度和不同糖濃度互相作用如何能夠構(gòu)成試管苗的最適生長環(huán)境，這有待進(jìn)一步探索。