米托蒽醌的合成及質(zhì)量評價Δ

王明明，蔡錦源，劉京，顧浦中，侍慧慧，張艷軍（.南京醫(yī)科大學康達學院，江蘇連云港000；.廣西科技大學鹿山學院，廣西柳州 54566）

血癌（白血病，Leukemia）是一種惡性腫瘤，是由克隆性白血病細胞大量增殖分化，彌散侵入人體正常組織器官而引發(fā)造血功能障礙和器質(zhì)性病變的嚴重危害人類健康的一種疾病[1-2]。臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱并引發(fā)細菌感染、貧血以及全身性多臟器的出血、淋巴結的腫大以及肝脾腫大等特征，目前臨床治療主要采用化療和骨髓移植的方案，且以化療為主[3-5]。

米托蒽醌（Mitoxantrone）又名絲裂蒽醌，是一種人工合成的蒽醌類化療藥物，具有抗腫瘤作用強、心臟毒性低的優(yōu)點，用于治療晚期乳腺癌、慢性淋巴細胞白血?。–hronic lymphocytic leukemia，CLL）和成人急性非淋巴細胞白血病等[6-7]。米托蒽醌進入人體后聚集在細胞核內(nèi)，抑制DNA拓撲異構酶Ⅱ，通過Cheng氏N-O-O三角活性藥效團[8-10]嵌入DNA的雙鏈結構，配對DNA堿基對，使堿基對之間的距離由0.34 nm增至0.68 nm，引起DNA的裂解[11-13]，阻斷DNA與RNA的合成。米托蒽醌的N-O-O三角活性藥效團及其嵌入DNA的示意圖見圖1。

圖1 米托蒽醌的N-O-O三角活性藥效團及其嵌入DNA的示意圖Fig 1 Triangular structure of N-O-O activity of mitoxantrone and DNAembedding diagram

在已報道的米托蒽醌的合成方法中鄭衛(wèi)等[14]研究了米托蒽醌類似物的合成，以4-甲基鄰苯二甲酸為原料，經(jīng)六步反應后得到化合物1，4-二羥基-6-氨乙基-9，10-蒽二酮，六步綜合收率為12.6%，合成步驟長、副產(chǎn)物多、收率低。本試驗采用1，4，5，8-四羥基蒽醌為原料優(yōu)化米托蒽醌的合成工藝，以期縮減合成步驟、提高收率、降低生產(chǎn)成本，并檢驗合成出的多批次樣品的理化特性，采用高效液相色譜法（HPLC）建立含量測定的方法，為米托蒽醌的合成和質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1220型HPLC儀（美國Agilent公司）；IRAffinity-1S型傅里葉變換紅外光譜儀和AP-125WD型萬分之一分析天平（日本Shimadzu公司）；ZF-20D型紫外可見全波段分析儀（上海遠懷化工科技有限公司）；WRR型熔點測定儀（上海精科實業(yè)有限公司）；Smart-Q型去離子純水機（美國The-Lab公司）；GZX-9070MBE型電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（鞏義予華儀器有限責任公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；KQ5200型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16C型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸米托蒽醌對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101134-201001，純度：98.9%）；1，4，5，8-四羥基蒽醌（山東西亞化學股份有限公司，批號：M3290，純度：96.0%）；1，4-二氧六環(huán)、N-（2-羥乙基）乙二胺、正己烷、無水硫酸鈣、無水甲醇、醋酸銨、乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）；水為純化水。

2 方法與結果

2.1 米托蒽醌的合成

2.1.1 米托蒽醌粗品的制備 稱取1，4，5，8-四羥基蒽醌 5 g（0.018 mol），氬氣保護下加入 1，4-二氧六環(huán) 32 mL，磁力攪拌至固體完全溶解，恒壓滴定漏斗逐滴加入N-（2-羥乙基）乙二胺15 g（0.15 mol），反應液為糊狀黏稠液體。持續(xù)攪拌，水浴50℃反應2 h，反應液為藍褐色油狀物，加入100 mL無水乙醇，調(diào)節(jié)水浴溫度至55℃，通入干空氣（無水硫酸鈣作為干燥劑）緩慢氧化4 h，反應液由藍褐色轉換為亮藍色。反應液放冷補足乙醇余量，將混合物轉移至250 mL廣口瓶中，室溫條件下放置24 h，待瓶底有明顯的固體沉降物，減壓抽濾得藍色結晶，即米托蒽醌粗品。米托蒽醌合成路線圖見圖2。

圖2 米托蒽醌合成路線圖Fig 2 Synthesis pathway of mitoxantrone

2.1.2 米托蒽醌粗品的精制 取米托蒽醌粗品結晶9.2 g，置于茄型瓶中，加入乙醇-正己烷（4∶1）混合液200 mL，加熱至完全溶解，加入適量活性炭，熱回流15 min，趁熱抽濾，濾液置于冷水中過夜析晶，抽濾得米托蒽醌晶體，晶體用乙醇-正己烷（3∶1）沖洗3次，得深藍色至藍黑色米托蒽醌粉末狀晶體2.8 g，產(chǎn)率為34.3%，顯微鏡觀察，調(diào)節(jié)目鏡倍率×10，物鏡倍率為×40，米托蒽醌微觀結構為分散狀晶態(tài)顆粒聚集體，顆粒大小為μm級，米托蒽醌粉末的顯微鏡圖見圖3。分別制備米托蒽醌供試品4批，批號分別為171102、171106、171112、180313。

2.2 米托蒽醌的理化特性以及結構鑒定

2.2.1 熔點測定 取干燥米托蒽醌供試品（批號：180313）適量，研細成粉末，置于一端封口的毛細管中，熔點儀測定熔點范圍為159.1～163.6℃，相對于米托蒽醌標準熔點170～174℃，鹽酸米托蒽醌標準品203～205℃，熔程偏寬，熔點明顯降低，表明藥物結晶中可能包埋有降低熔點的雜質(zhì)，難以通過重結晶方式除去。

圖3 米托蒽醌粉末的顯微鏡圖Fig 3 Microscopic morphology of mitoxantrone

2.2.2 pH測定 取各批次米托蒽醌供試品粉末0.05 g，加水25 mL振蕩使完全溶解，制備成每1 mL含2 mg藥物的溶液，中性濾紙濾過，攪拌均勻，室溫條件下放置5 min，待溶液澄明穩(wěn)定，作為pH測定液A。取測定液A加水稀釋100倍，同法操作，作為pH測定液B。分別測定測定液A和測定液B的pH值，每批次樣品各測3次。結果表明，米托蒽醌高濃度條件下（測定液A）偏堿性，稀釋后水溶液（測定液B）近中性，合成的批次產(chǎn)品間pH差異小，室溫下溶液短時期內(nèi)理化特性穩(wěn)定。不同批次米托蒽醌水溶液pH值的測定結果見表1。

表1 不同批次米托蒽醌水溶液pH值的測定結果Tab 1 pH value of different batches of mitoxantrone solution

2.2.3 紫外-可見吸收光譜的檢測 取各批次米托蒽醌供試品，加水溶解制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，置于吸收池中，調(diào)節(jié)紫外-可見波段為200～800 nm，掃描速度為快速，采樣間隔為0.5 nm進行掃描。不同批次米托蒽醌水溶液的紫外-可見光全波段掃描光譜圖見圖4。

圖4 不同批次米托蒽醌水溶液的紫外-可見光全波段掃描光譜圖Fig 4 UV full-band screening spectrum of different batches of mitoxantrone solution

圖4顯示，4批次的米托蒽醌均在紫外波段235～245 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)紫外最大吸收峰，268 nm波長處附近存在肩峰，在可見光波段590～600 nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)可見光最大吸收峰，部分樣品在680 nm波長處出現(xiàn)可見光的等吸收點，提示4批次米托蒽醌的紫外-可見波段光譜吸收曲線基本保持一致。

2.2.4 紅外結構特征的鑒定 取米托蒽醌供試品（批號：180313）1 mg，置于瑪瑙研缽中，加入干燥的溴化鉀粉末約200 mg，充分研磨，壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀檢測紅外光譜，米托蒽醌的紅外光譜圖見圖5。

圖5 米托蒽醌的紅外光譜圖Fig 5 IR spectrum of mitoxantrone

圖5顯示，米托蒽醌的紅外特征與《藥品紅外光譜集》（2015年版）中米托蒽醌項下描述一致，其中3 317 cm－1處為飽和烴碳支鏈末端羥基和羥基的吸收峰，峰形尖銳，向低波數(shù)產(chǎn)生位移，游離脂肪族羥基與酚羥基有一定程度的締合，但產(chǎn)品在固體狀態(tài)下締合力弱，故不會產(chǎn)生明顯的寬峰；2 940 cm－1和2 859 cm－1處為仲胺基團的吸收峰，這是由于苯環(huán)上連接的仲胺基團受到苯環(huán)電子團的共軛作用，與芳雜環(huán)連接的近端氨基與遠端氨基發(fā)生分離，產(chǎn)生尖銳的雙峰；1 609、1 569、1 475、1 448.82 cm－1為骨架蒽醌環(huán)的特征吸收峰，本品研磨壓片時所用的量低于常規(guī)壓片用量，因為本品透光率差，常規(guī)濃度下吸收峰透光率低易掩蔽特征吸收。

2.2.5 干燥失重的考察 取各批次的干燥米托蒽醌供試品粉末約1.0 g，均勻分散，平鋪于直徑為5 cm的扁平稱量瓶中，置于105℃干燥箱中干燥2 h至恒重，取出置于密封干燥器中放冷，精密稱定，計算失水率[（干燥前質(zhì)量－干燥后質(zhì)量）/干燥前質(zhì)量×100%]。不同批次米托蒽醌干燥失重結果見表2。

表2 不同批次米托蒽醌干燥失重結果Tab 2 Drying weightlessness of different batches of mitoxantrone

2.2.6 臨界相對濕度（CRH）的測定 ①恒溫恒濕條件：制備CH3COOK、MgCl2、K2CO3、NaBr、KCl、KNO3的飽和鹽溶液各1份，分別置于密閉干燥器中，設定溫度25℃。各鹽溶液對應濕度關系見表3。②吸濕平衡時間的測定：精密稱取干燥至恒重的米托蒽醌供試品粉末（批號：180313）約50 mg，均勻鋪散于干燥至恒重的敞口具塞稱量瓶中，再置于溫度25℃、相對濕度75%的密閉環(huán)境中，每隔4 h取出稱量瓶，精密稱定。考察樣品于不同時間點（0、6、9、21、28、36、52、61 h）的累積吸濕量，計算吸濕百分率[（吸濕后質(zhì)量－吸濕前質(zhì)量）/吸濕前質(zhì)量×100%]，以放置時間為橫坐標，吸濕百分率為縱坐標，繪制吸濕平衡曲線，找出樣品吸濕量處于平衡狀態(tài)下所對應的時間折點為吸濕平衡時間。結果顯示，米托蒽醌的吸濕平衡時間為48 h。米托蒽醌在溫度25℃、相對濕度75%條件下放置不同時間的吸濕百分率見表4，對應的吸濕平衡曲線見圖6。③CRH的測定：精密稱取干燥至恒重的米托蒽醌供試品粉末（批號：180313）約50 mg，共計6份，同②法操作，分別置于①中6種飽和鹽溶液密閉濕度環(huán)境中，室溫25℃放置48 h，取出后精密稱定。以環(huán)境濕度為橫坐標，樣品吸濕百分率為縱坐標，繪制CRH曲線，在CRH曲線的高低濕度處選取一點作切線，兩切線交于一點，該交點的橫坐標對應的環(huán)境濕度記作米托蒽醌的CRH值。溫度25℃下米托蒽醌在不同鹽溶液（濕度）下的吸濕百分率見表3，對應的CRH曲線見圖7。

表3 溫度25℃下米托蒽醌在不同鹽溶液（濕度）下的吸濕百分率Tab 3 Hygroscopicity percentage of mitoxantrone in different salt solution（humidity）at 25 ℃

表4 米托蒽醌在溫度25℃、相對濕度75%%條件下放置不同時間的吸濕百分率Tab 4 Hygroscopicity percentage of mitoxantrone placing for different time at 25℃with relative humidity of 75%%

圖7顯示，25℃下米托蒽醌的CRH為54.7%，吸濕百分率為2.4%，提示米托蒽醌在常溫常濕條件下（溫度25℃，相對濕度40%）貯存易吸收環(huán)境中的水份，具有引濕性，但不會潮解，長期存放應干燥后密封貯存。

圖6 米托蒽醌在溫度25℃、相對濕度75%%條件下的吸濕平衡曲線Tab 6 Water absorption percentage of mitoxantrone placing for different time at 25℃with humidity of 75%%

圖7 溫度25℃下米托蒽醌在不同鹽溶液（濕度）的CRH曲線Fig 7 Hygroscopic equilibrium curve of mitoxantrone in different salt solution（humidity）at 25 ℃

2.3 米托蒽醌的含量測定

2.3.1色譜條件色譜柱：Agilent BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙酸銨水溶液（0.2 mol/L，pH＝4.4）-乙腈（1∶4，V/V）；檢測波長：242 nm；柱溫：30℃；流速：0.5 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3.2 對照品溶液的制備 取米托蒽醌對照品25.43 mg，精密稱定，置于100 mL量瓶中，水溶解稀釋定容至刻度，搖勻，作為貯備液；精密量取1 mL貯備液，置于25 mL量瓶中，流動相溶解稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm有機濾膜過濾，作為對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取批號分別為180313、171102、171106、171112的米托蒽醌供試品各25 mg，精密稱定，流動相稀釋制成質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的溶液，作為供試品溶液。

2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗 用流動相制成米托蒽醌質(zhì)量濃度為 0.01 mg/mL，1，4，5，8-四羥基蒽醌質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL的混合溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。取系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液（批號：180313），按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，米托蒽醌出峰時間為10.23 min，理論板數(shù)以米托蒽醌峰計不低于6 000，對稱因子大于0.75；1，4，5，8-四羥基蒽醌出峰時間為12.36 min，相鄰峰分離度均大于2。色譜圖見圖8。

圖8 高效液相色譜圖Fig 8 HPLC chromatograms

2.3.5 線性關系考察 精密量取米托蒽醌貯備液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL，分別置于25 mL量瓶中，流動相溶解稀釋定容至刻度，搖勻，0.22 μm有機濾膜過濾，作為50%、80%、100%、120%、150%系列標準曲線溶液。各精密量取系列標準曲線溶液10 μL進樣，每份樣品平行測定2次，以米托蒽醌峰面積（A）為縱坐標、質(zhì)量濃度（c）為橫坐標繪制標準曲線。得回歸方程為A＝6.555 0×103c－1.375 9（r＝0.999 8），結果表明，米托蒽醌在質(zhì)量濃度為5.086～15.258 μg/mL范圍內(nèi)保持良好的線性。

2.3.6 精密度試驗 精密量取米托蒽醌對照品溶液10 μL，按照“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為0.19%（n＝6），表明儀器精密度符合要求。

2.3.7 準確度試驗 精密量取已知含量的米托蒽醌水溶液（批號：180313）1 mL，置于100 mL量瓶中，水稀釋溶解定容至刻度，精密量取上述溶液1 mL，共9份，分別置于100 mL量瓶中，精密稱取米托蒽醌對照品約5.15、7.15、9.15 mg，各3份，分別置于上述9個100 mL量瓶中，水溶解混勻稀釋至刻度，分別作為80%、100%、120%濃度水平的溶液，各精密量取1 mL置于10 mL量瓶中，流動相溶解稀釋至刻度，進樣10 μL，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量，計算回收率。結果顯示，米托蒽醌的平均回收率為99.85%，RSD%為1.69%（n＝9），回收率試驗結果見表5。

表5 回收率試驗結果Tab 5 Results of recovery tests

2.3.8 耐用性試驗 取供試品溶液（批號：180313），分別改變“2.3.1”項下色譜條件中的pH（水相pH改為4.4±0.2）、柱溫[柱溫改為（30±2）℃]、流動相比例[乙腈占流動相體積比改為（80±5）%范圍內(nèi)]等因素，考察本品測定結果在色譜條件改變下的耐受程度。結果表明，調(diào)節(jié)pH、柱溫、流動相比例后米托蒽醌的出峰時間和峰形都穩(wěn)定，表明該色譜條件耐用性良好。

2.3.9 含量測定 精密量取各批次米托蒽醌供試品溶液，按照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。主成分含量以對照品外標法計算，結果顯示，批號分別為180313、171102、171106、171112的米托蒽醌供試品中米托蒽醌含量分別為83.2%、76.3%、73.9%、79.1%，平均值為78.1%。

3 討論

本試驗以1，4，5，8-四羥基蒽醌作為原料，隔絕空氣（氬氣保護）恒溫的試驗條件下制備出米托蒽醌粗品，其中氬氣保護是必須的，研究發(fā)現(xiàn)通過氮氣保護后制備的產(chǎn)品經(jīng)過隔夜重結晶操作后產(chǎn)率只相對于氬氣保護產(chǎn)率的50%～70%，這可能是由于反應混合液質(zhì)地黏稠，流動性差，攪拌過程中易于摻雜氣泡，而氬氣的密度比重相對于氮氣更大，可有效地排除體系中的空氣，抑制羥基的酯化、氧化等副反應，促進C—N鍵的生成；同時反應溫度也是至關重要的，50～55℃為最佳的反應溫度，溫度升高至60℃以上時，米托蒽醌產(chǎn)率降低，雜質(zhì)增多，產(chǎn)品呈非晶體態(tài)的松散粉末；反應溫度低于50℃時，原料反應不完全，反應液呈棕色。米托蒽醌粗品的制備需經(jīng)過24 h的析晶操作促使晶體顆粒從乙醇溶液中析出，不宜采用冰水浴加速析出過程，室溫下過長或過短時間的析晶過程易導致結晶的失敗，最佳的結晶時長為12～24 h。

精制得到的米托蒽醌具有極強的水溶性，干燥后產(chǎn)品為粉末，易吸收空氣中水分而使自身潮解，研究CRH能夠更好地了解物料的特性，有效控制物料的貯存條件，防止藥品在長期貯存過程中的潮解和霉變[15-18]。本研究結果顯示，25℃下米托蒽醌的CRH為54.7%，提示該產(chǎn)品在潮濕環(huán)境中存放易吸潮和水化。相對于2015年版《中國藥典》藥物引濕性試驗指導原則，本研究中CRH測定方法顯著改善了測量樣品的稱樣量，這是基于提高試驗數(shù)值的準確性、減少系統(tǒng)誤差的考慮，對于樣品分散程度也作出了嚴格的規(guī)定，各批次試驗中要求鋪層的高度為2 mm，鋪散層為直徑為1 cm的圓餅狀，這類處理有利于試驗數(shù)值的一致性和平行性考察，同時該試驗中的光譜及色譜學檢測標準依據(jù)試驗要求也作了合理的調(diào)整，有利于結果的觀察和測定。本試驗未考察有關物質(zhì)指標，因考慮到合成中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)為米托蒽醌同分異構體，采用常規(guī)C18色譜柱分離檢測，同分異構體檢測峰之間會產(chǎn)生疊加和包埋現(xiàn)象，干擾結果測定，可考慮進一步采用手性分離色譜柱和質(zhì)譜聯(lián)用技術作為今后的研究內(nèi)容。

米托蒽醌是一種人工合成的治療淋巴瘤的特效藥，采用全合成方法制備，合成路線長、副產(chǎn)物多、提純困難，造成原料藥價格昂貴[19-20]。本試驗采用1，4，5，8-四羥基蒽醌作為合成原料，溫和綠色的試驗條件下制備的米托蒽醌產(chǎn)品經(jīng)精制后產(chǎn)率高達34.3%，產(chǎn)品的理化特性經(jīng)檢驗符合原料藥用藥需求，建立的HPLC分析方法適用于原料藥含量的測定，4批米托蒽醌的平均含量為78.1%，其中批號180313的米托蒽醌供試品中米托蒽醌含量可達83.2%，產(chǎn)品純凈、雜質(zhì)少。本試驗中米托蒽醌的分析方法穩(wěn)定性好、重復性好、分析快速、結果準確可靠，合成的產(chǎn)品純度高、副產(chǎn)物低、制備工藝簡單易行，可考慮將該方法用于進一步擴大化生產(chǎn)。