推拿手法對(duì)家兔骨骼肌失神經(jīng)支配后雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)的影響

郭汝寶

周圍神經(jīng)損傷是指周圍神經(jīng)神經(jīng)干或分支受到損害后，引起軀體感覺(jué)障礙、運(yùn)動(dòng)功能減退等癥狀的一類病癥，臨床常見、多發(fā)[1]。對(duì)于周圍神經(jīng)損傷的治療是目前臨床上的難點(diǎn)，雖然近些年神經(jīng)損傷的修復(fù)水平已經(jīng)有了明顯的提高，但仍然不盡如人意[2]。本研究擬通過(guò)推拿手法作用于骨骼肌失神經(jīng)支配的家兔，觀察損傷神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)變化以及雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白的表達(dá)水平，研究推拿手法對(duì)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)以及失神經(jīng)支配后骨骼肌再生的的治療作用及可能機(jī)制，報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 清潔級(jí)雄性健康新西蘭家兔120只，6月齡，體質(zhì)量（2.0±0.3）kg，許可證號(hào)：SCXK（浙）2015-0004。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，于20℃恒溫環(huán)境單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間，予家兔標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料（由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）及自由飲水。

1.2 藥 物 注射用青霉素鈉（規(guī)格：80萬(wàn)iu/支，批號(hào)130836-2，江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司）；注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子（商品名：蘇肽生，規(guī)格30ug/支，批號(hào)S20060023，北京舒泰神生物制藥股份有限公司）。

1.3 儀器與試劑 電子天平（上海美特勒-托利多儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；透射電鏡（德國(guó)Leica公司）；超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）；圖像分析系統(tǒng)Image-ProPlus 5.1；戊二醛；PBS緩沖液；檸檬酸三鈉；4%多聚甲醛；鋨酸固定液；100%丙酮；3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛；UW（University of Wisconsin）液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 計(jì)算機(jī)隨機(jī)區(qū)組分為四大組：正常對(duì)照組、模型組、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）治療組、手法治療組，各30只，為了對(duì)檢測(cè)指標(biāo)做一連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察，依據(jù)我們前期的研究結(jié)果，各組又按照取材時(shí)間不同進(jìn)一步細(xì)分為5個(gè)亞組，分別為：2周亞組、3周亞組、1個(gè)月亞組、2個(gè)月亞組、4個(gè)月亞組。每個(gè)亞組各6只家兔。

2.2 動(dòng)物造模 模型組、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）治療組、手法治療組家兔均行右后肢脛神經(jīng)切斷術(shù)，建立失神經(jīng)支配模型[3]。具體操作：3%戊巴比妥鈉溶液，按0.7mL/kg劑量耳緣靜脈緩慢注射麻醉后，將家兔固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，右后肢剃毛，暴露大腿后部及腘窩。局部消毒，于膝上股后外側(cè)切開小口，暴露脛神經(jīng)，玻璃分針鈍性分離脛神經(jīng)后，于脛神經(jīng)上端處切斷脛神經(jīng)干，并將近端神經(jīng)游離端向上折返縫入股二頭肌內(nèi)，逐層縫合切口，于切口附近注射青霉素，預(yù)防感染。左后肢不做任何處理。正常對(duì)照組家兔僅于右后肢膝上股后外側(cè)做同樣大小切口，暴露脛神經(jīng)，不做切斷處理，消毒縫合切口同前。

2.3 干預(yù)措施 手法治療組推拿干預(yù)手法為按揉法，按照《中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書·中醫(yī)學(xué)》中的手法操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作[4]。手法的輕重及頻率均通過(guò)FZ－I型推拿手法測(cè)力分析儀標(biāo)定，由專人經(jīng)訓(xùn)練后，于手法組家兔術(shù)側(cè)腓腸肌上操作。具體操作方法：用兔用固定器固定家兔，雙后肢伸出，操作者一手固定其右下肢，暴露腓腸肌部位，另一手置于腓腸肌上，沿著腓腸肌走行，給予按揉手法操作。按揉法的參數(shù)：壓力19.6N、頻率 140次/min，每次 10min，每天 1次，于造模后第四天開始手法干預(yù)。正常組及模型組同樣給予兔用固定器固定10min，但不進(jìn)行推拿手法操作。神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）治療組：注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子30μg，2mL注射用水溶解，予家兔右后肢腓腸肌肌肉注射，每天1次，連用3周，在造模后第4天家兔右后肢腓腸肌部位注射。模型組造模成功后，不給予任何干預(yù)措施。正常對(duì)照組不給予任何干預(yù)措施。

2.4 取材時(shí)間 三大組按照取材時(shí)間的不同，分別在手法干預(yù)2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月后各取6只家兔行相應(yīng)的指標(biāo)檢測(cè)。

2.5 肌濕重比檢測(cè) 將家兔過(guò)度麻醉后，將雙側(cè)腓腸肌沿股骨內(nèi)外髁起點(diǎn)至跟骨結(jié)節(jié)止點(diǎn)完整取下，用電子天平稱量腓腸肌的肌濕重，計(jì)算術(shù)側(cè)與健側(cè)的比值，即為肌濕重比。

2.6 雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)免疫組化法測(cè)定取家兔右后肢斷端遠(yuǎn)端脛神經(jīng)約1cm組織，預(yù)冷生理鹽水漂洗去表面血塊后，將神經(jīng)標(biāo)本置入U(xiǎn)W（U－niversity of Wisconsin）液中，每20mL UW液浸泡10條神經(jīng)標(biāo)本，將所取組織置于4%多聚甲醛固定液內(nèi)后固定24h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)縱切片（片厚5μm）。采用SP法常規(guī)染色。每例檢測(cè)3張切片，采用采用Zeiss ImergerA1顯微鏡和DXM1200 FCCD圖像采集系統(tǒng)觀察并照相，光鏡下陽(yáng)性反應(yīng)物為突出背景的棕黃色顆粒，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)Image-ProPlus 5.1測(cè)定其積分光密度。

2.7 神經(jīng)組織超薄切片透射電鏡觀察 迅速暴露出術(shù)側(cè)下肢被切斷脛神經(jīng)的遠(yuǎn)端部分，并于1min內(nèi)完整取下，冰臺(tái)上切取成三段（近段、中段、末段），每段損傷神經(jīng)組織約5mm。將其中近段神經(jīng)組織放入4℃預(yù)冷的3%電鏡專用戊二醛固定液中，4℃冰箱中避光保存、固定2h以上，取出組織后，PBS漂洗15min×3次，1%鋨酸固定液固定1.5h（通風(fēng)櫥內(nèi)操作），PBS漂洗15min×3次，依次按50%、70%、80%、90%酒精梯度脫水，15min×1次，100%酒精脫水20min×1次，100%丙酮20min×2次，無(wú)水丙酮與包埋劑（1：1體積混合）滲透組織1h，無(wú)水丙酮與包埋劑（1：3體積混合）滲透組織3h，純埋劑滲透組織并震蕩過(guò)夜，純包埋劑包埋。修塊成型后，超薄切片機(jī)做超薄切片，厚度約為50nm。超薄切片染色用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色20min。透射電子顯微鏡下觀察，拍片。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組家兔腓腸肌肌濕重比比較 模型組、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）治療組、手法治療組家兔各時(shí)間點(diǎn)肌濕重比均降低。NGF治療組在2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月，手法治療組在2周、3周、1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。手法治療組在2周、3周低于NGF治療組，4個(gè)月時(shí)則高于NGF治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3.2 各組家兔雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)光密度值比較 NGF治療組、手法治療組家兔各個(gè)時(shí)期均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。手法治療組在1個(gè)月、2個(gè)月均高于NGF治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

3.3 各組家兔損傷神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)比較 正常對(duì)照組可見髓神經(jīng)纖維數(shù)量多，成熟度均勻，并且直徑大，軸突上存在完整、光滑的軸膜，軸漿豐富，軸漿中神經(jīng)微絲、微管排列規(guī)整，以縱行為主，髓鞘結(jié)構(gòu)完整，層板質(zhì)地均勻，排列緊密，明暗相間，層板間無(wú)裂隙；模型組散見新生髓鞘結(jié)構(gòu)，層板不緊密，形狀多變欠規(guī)整，軸漿偏少，其內(nèi)細(xì)胞器較少；NGF治療組可見新生髓鞘多，形態(tài)較規(guī)整，髓鞘較厚，低于正常髓鞘結(jié)構(gòu)，層板緊密，發(fā)育程度不一致，顏色深淺不一，軸漿充足，細(xì)胞器較豐富，周圍聚集的雪旺細(xì)胞細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核清晰；手法治療組可見新生髓鞘多，形態(tài)較規(guī)整，髓鞘較厚，低于正常髓鞘結(jié)構(gòu)，層板緊密，發(fā)育程度不一致，顏色深淺不一，軸漿充足，細(xì)胞器較豐富，周圍聚集的雪旺細(xì)胞細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核清晰。見插頁(yè)圖1。

4討 論

研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)損傷后，局部組織通過(guò)推拿手法干預(yù)，局部肌肉興奮，肌組織代謝增強(qiáng)交換，有害代謝產(chǎn)物堆積減少，從而改善失神經(jīng)后萎縮的骨骼肌組織的代謝過(guò)程，同時(shí)也促進(jìn)了一系列肌源性生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生及骨骼肌再生分化，使肌肉纖維化進(jìn)程得到控制，延緩廢用性萎縮的發(fā)生[5-7]。此外，因神經(jīng)髓鞘對(duì)缺血缺氧十分敏感，手法通過(guò)促進(jìn)局部血供，可減少神經(jīng)內(nèi)正常髓鞘的變性，減輕神經(jīng)瘢痕化，共同促進(jìn)受損傷神經(jīng)與肌肉的恢復(fù)[8]。

表1 各組家兔腓腸肌肌濕重比比較（

表1 各組家兔腓腸肌肌濕重比比較（

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與 NGF 治療組比較，▲P＜0.05；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子

組別正常對(duì)照組模型組NGF治療組手法治療組家兔數(shù)6666 2周1.00±0.02 0.53±0.01*0.79±0.03*△0.72±0.05*△▲3周0.99±0.03 0.41±0.03*0.70±0.06*△0.55±0.04*△▲1個(gè)月0.99±0.02 0.40±0.03*0.58±0.04*△0.55±0.09*△2個(gè)月1.06±0.06 0.38±0.05*0.44±0.05*△0.49±0.03*△4個(gè)月1.05±0.05 0.38±0.05*0.42±0.02*0.50±0.03*△▲

表2 各組家兔腓腸肌雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)光密度值比較

表2 各組家兔腓腸肌雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)光密度值比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與 NGF 治療組比較，▲P＜0.05；NGF：神經(jīng)生長(zhǎng)因子

組別正常對(duì)照組模型組NGF治療組手法治療組家兔數(shù)6666 2周3.42±0.54 10.33±1.51*29.17±3.97*△27.00±6.29*△3周3.58±0.46 20.83±3.87*35.50±4.23*△33.17±5.27*△1個(gè)月4.01±0.87 21.17±4.62*32.83±4.12*△51.00±4.56*△▲2個(gè)月3.36±0.27 30.67±3.27*47.00±5.06*△75.83±9.66*△▲4個(gè)月3.73±0.52 53.17±7.52*113.67±13.08*△116.67±3.10*△

周圍神經(jīng)損傷之后，作為周圍神經(jīng)靶器官的骨骼肌因缺失神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和自身廢用，迅速萎縮并失去收縮功能，大體標(biāo)本上最突出的表現(xiàn)是肌肉萎縮。肌濕重是實(shí)驗(yàn)中常用于觀察骨骼肌萎縮情況的一項(xiàng)宏觀指標(biāo)。以往研究觀察到，周圍神經(jīng)切斷損傷后，相關(guān)骨骼肌肌濕重迅速出現(xiàn)下降，隨在損傷時(shí)間延長(zhǎng)而下降速度趨緩[9]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組2周時(shí)，腓腸肌肌濕重比已有顯著下降（P<0.05），表明家兔行脛神經(jīng)切斷術(shù)后，腓腸肌失去神經(jīng)支配，萎縮明顯，達(dá)到了我們研究時(shí)需要觀察損傷神經(jīng)修復(fù)與萎縮骨骼肌修復(fù)兩個(gè)方面的需求；3周后肌濕重比下降趨勢(shì)變緩，與以往研究相近。與模型組相比，手法治療組各時(shí)間點(diǎn)肌濕重比值顯著增加（P<0.05）。另一方面，手法治療組4個(gè)月時(shí)則顯著高于NGF治療組（P＜0.05），這表明手法治療的遠(yuǎn)期療效好于NGF治療。

周圍神經(jīng)損傷主要的治療環(huán)節(jié)之一就是失神經(jīng)骨骼肌萎縮的治療和預(yù)防,這直接關(guān)系到周圍神經(jīng)的恢復(fù)和預(yù)后[10]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雪旺氏細(xì)胞（Schwann cells）通過(guò)分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能夠有效促進(jìn)神經(jīng)元再生[11-12]。周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)再生很大程度上依賴于損傷遠(yuǎn)側(cè)端殘留雪旺氏細(xì)胞的活性[13]。周圍神經(jīng)損傷后，雪旺氏細(xì)胞大量增殖并沿基膜管形成索狀的Bngner帶，誘導(dǎo)軸突再生并扮演臨時(shí)靶器官的角色[14]。雪旺氏細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)軸突具有顯著的支持和保護(hù)作用，進(jìn)而在周圍神經(jīng)受損后的修復(fù)過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用，它能通過(guò)大量的增生和包繞再生軸索，來(lái)完成髓鞘化后的修復(fù)工作[15]。隨著失神經(jīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)纖維、軸漿及其內(nèi)容物、髓鞘結(jié)構(gòu)基本崩解消失，殘留少量髓鞘殘片，但就觀察到的雪旺細(xì)胞的分布密度以及細(xì)胞器豐富程度而言，手法治療組明顯好于NGF治療組及模型組。而雪旺細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的豐富度部分反映了細(xì)胞的活力，因此手法干預(yù)之后，損傷神經(jīng)組織中雪旺細(xì)胞的成熟度與活躍度得到了促進(jìn)。

作為周圍神經(jīng)的標(biāo)志蛋白質(zhì)，S-100既可以反映周圍神經(jīng)損傷的雪旺細(xì)胞得增值情況，又可以反映髓鞘的形成情況[16]。本研究結(jié)果也表明，骨骼肌失神經(jīng)支配后，雪旺氏細(xì)胞S-100蛋白表達(dá)上調(diào)，NGF治療組、手法治療組在各個(gè)時(shí)期均高于模型組，但手法治療組在1個(gè)月、2個(gè)月均高于NGF治療組（P＜0.05）。表明推拿手法可能有NGF樣治療作用，同時(shí)在早期優(yōu)于NGF的治療效果。

因此，推拿手法可以延長(zhǎng)肌細(xì)胞正常形態(tài)結(jié)構(gòu)存在時(shí)間，明顯減少成纖維細(xì)胞和脂肪細(xì)胞增生程度，延緩失神經(jīng)支配后肌肉的萎縮，促進(jìn)損傷神經(jīng)中雪旺細(xì)胞增殖及髓鞘新生、成熟，為周圍神經(jīng)損傷后肌肉受神經(jīng)成功再支配保留基礎(chǔ)，推拿手法干預(yù)對(duì)促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)及延緩骨骼肌的萎縮是有效的。