適宜泌乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的益生菌篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

◆作者：亓秀曄＊謝全喜 劉乃芝 徐海燕 程福亮 谷 巍

◆單位：山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵技術(shù)開(kāi)發(fā)新型飼料資源越來(lái)越受到人們的重視。微生態(tài)制劑是一種利用正常微生物或促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的經(jīng)過(guò)特殊加工制成的活的能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)有益微生物生長(zhǎng)繁殖、抑制致病菌生長(zhǎng)繁殖、具有防病作用的微生物制劑。常用的微生態(tài)制劑主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等，其中乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內(nèi)的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產(chǎn)性能；其代謝產(chǎn)物,抑菌效果強(qiáng)，對(duì)減少抗生素的使用，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值；此外，乳酸菌發(fā)酵飼料作為功能性飼料，其還具有氣味香、適口性好、飼喂簡(jiǎn)單方便、消化率高、功效穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值，其在飼料領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大潛力。酵母菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸（粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%）及多種維生素，同時(shí)含有多種動(dòng)物所需的消化酶（α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等）和其他代謝產(chǎn)物，在提高動(dòng)物的免疫、生長(zhǎng)和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價(jià)格低廉并有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求旺盛，具有很好的應(yīng)用前景。

母豬泌乳力是反映母豬繁殖性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，泌乳母豬的乳品質(zhì)對(duì)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育、免疫力、斷奶體重等都有重要影響，母豬乳成分的變化直接影響哺乳仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。而泌乳母豬采食量的提高直接使母豬泌乳量的增多，進(jìn)而提高仔豬斷奶窩重和成活率。研究表明微生態(tài)制劑中的微生物如乳酸菌本身含有大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被母豬攝取利用后在其發(fā)酵或代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生類似促生長(zhǎng)素的生理活性物質(zhì)，直接或間接地促進(jìn)與泌乳有關(guān)激素的分泌，增強(qiáng)乳腺發(fā)育分泌活動(dòng)，為仔豬提供充足的乳汁營(yíng)養(yǎng)，提高仔豬的生長(zhǎng)性能。然而乳酸菌在適宜的pH范圍內(nèi)才可大量繁殖，從而使pH大幅下降使其繁殖的條件被破壞，從而不利于腸道微生態(tài)環(huán)境。因此，本試驗(yàn)旨在研究乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵泌乳母豬全價(jià)料，篩選最適宜菌株，并從混菌比例、水分、溫度和時(shí)間等關(guān)鍵因素研究對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化進(jìn)行測(cè)定，以期能降低發(fā)酵飼料的生產(chǎn)成本，篩選出適宜乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米-豆粕型泌乳母豬配合飼料由山東泰安普瑞納飼料有限公司提供。

乳酸桿菌（Lactic acidbacteria）：BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLC C2-0111、BLCC2-0114；

酵母菌(Yeast)：BLCC4-0021、BLCC4-0042、BLCC4-0044 和BLCC4-0048。菌株均由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存。

乳酸桿菌發(fā)酵用MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏 8g/L、酵母膏 4g/L、硫酸鎂0.5g/L、硫酸錳0.3g/L、檸檬酸銨2g/L、乙酸鈉5g/L、吐溫 -801mL/L，pH 值 6.0，121 ℃滅菌20min。

酵母菌發(fā)酵用培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵液的制備

將4℃保存條件下的乳酸桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 ml MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24h備用；將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50mL酵母培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16h備用。

1.2.2 乳酸桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比 1∶0.4（g∶mL)配制好，裝袋（100g/袋），每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24h、48h和72h取樣，測(cè)定pH、活菌數(shù)和總酸含量。

1.2.3 酵母菌的篩選

稱取一定量的基料于500mL三角瓶中，料水比為1.0∶0.4（g∶mL），裝量 50g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，均置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48和72h取樣，測(cè)定活菌數(shù)和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 乳酸桿菌和酵母菌混合發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1配合飼料混菌發(fā)酵菌種接種量組合試驗(yàn)

將2種菌種按照3個(gè)不同接種量進(jìn)行2因素3水平正交試驗(yàn)，如表1所示。溫度設(shè)定為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48h，料水比為1∶0.6，測(cè)定發(fā)酵料pH值、乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，確定發(fā)酵配合飼料的菌種接種量最佳組合。

1.2.4.2混菌發(fā)酵配合飼料工藝優(yōu)化試驗(yàn)

（1）在確定最優(yōu)接種量組合的基礎(chǔ)上，將料水比分別設(shè)定為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，在30℃條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵48h。取樣測(cè)定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，考察物料不同水分含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

表1 混菌發(fā)酵接種量組合的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（2）在選定的最優(yōu)料水比基礎(chǔ)上，設(shè)置5個(gè)發(fā)酵溫度（25、28、32、37、42 ℃）進(jìn)行發(fā)酵 48h。取樣測(cè)定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，考察不同溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

（3）在選定的最優(yōu)料水比和發(fā)酵溫度條件下進(jìn)行發(fā)酵48h。取樣測(cè)定發(fā)酵料pH、乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，以確定最優(yōu)的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

（1）樣品pH測(cè)定：取10g樣品加入90mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

（2）乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)，并換算成每克發(fā)酵料所含菌落數(shù)，結(jié)果用CFU/g表示。

（3）粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：采用凱氏定氮法。

（4）總酸含量的測(cè)定：采用酸堿滴定法測(cè)定樣品中總酸含量。

（5）酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參照 QB/T2653-2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品2.00g，加入15%三氯乙酸溶液25mL，混合均勻，靜置30min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4000r/min條件下離心10min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測(cè)定方法。結(jié)果為占粗蛋白的百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行初步處理后，采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用 One-way ANOVA進(jìn)行方差分析，LSD法進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

由表 2可知，pH值：24h時(shí)，除BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對(duì)照組 (P＜0.05)，其中以BLCC2-0015最低；48h和72h時(shí)，各pH值均有所下降，以BLCC2-0015和BLCC2-0092較低，BLCC2-0015在發(fā)酵48h時(shí)達(dá)到最低，僅為4.12。

活菌數(shù)方面：各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109水平，各取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)均以 BLCC2-0015和BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中BLCC2-0092發(fā)酵48h活菌數(shù)達(dá)到81×108cfu/g。

總酸含量方面：各菌株發(fā)酵料總酸含量均逐漸升高，以BLCC2-0015和BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組(P＜0.05)。其中以72h-BLCC2-0015最高，為24.84mg/g。

表2 乳酸桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

綜合pH值、活菌數(shù)和總酸含量，適宜泌乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳酸菌優(yōu)選BLCC2-0015。

2.2 酵母菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

由表 3可知，BLCC4-0048在發(fā)酵24h、48h和 72h時(shí)活菌數(shù)均在108CFU/g水平，其余菌株均在109CFU/g水平。24h以BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，其次是BLCC4-0042；48h和72h時(shí)均以BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，72h時(shí)為53.50×108CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，兩者間差異不顯著（P＞0.05）。由粗蛋白含量來(lái)看，各菌株間差異均不顯著（P＞0.05），其中以 BLCC4-0021和BLCC4-0042發(fā)酵時(shí)稍高。

綜合考慮，適宜泌乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的酵母菌優(yōu)選BLCC4-0021。

2.3 乳酸桿菌和酵母菌混合發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 混菌發(fā)酵菌種的最佳組合

表3 酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

表4 混菌發(fā)酵各菌種接種量組合的正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 料水比對(duì)混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

由表3可知，pH值以試驗(yàn)5、7、8組和9組最低，顯著低于其余其他組(P＜0.05)，但該4組間差異不顯著（P＞0.05），以試驗(yàn)8組最低；乳酸桿菌活菌數(shù)以試驗(yàn)8組最高，顯著高于其余各組(P＜0.05)，但各組間活菌數(shù)均在同一數(shù)量級(jí)；酵母菌活菌數(shù)方面較乳酸桿菌活菌數(shù)降低1個(gè)數(shù)量級(jí)，以試驗(yàn)8組最高；總酸含量來(lái)看，試驗(yàn)4-9組高于試驗(yàn)1-3組，試驗(yàn)4-9組間差異不顯著（P＞0.05），以試驗(yàn)7組最高，其次為試驗(yàn)8組；酸溶蛋白含量來(lái)看，以試驗(yàn)8組和試驗(yàn)9組最高，顯著高于其他各組 (P＜0.05)，以試驗(yàn)8組最高，其次為試驗(yàn)9組。綜合各項(xiàng)指標(biāo)分析，混合菌種發(fā)酵的最佳菌種組合為第8組，即乳酸桿菌：酵母菌=1.5%∶1.0%，在該組合下酸溶蛋白含量達(dá)到最大值為15.04%，總酸含量較高，達(dá)到22.68mg/g。

表6 發(fā)酵溫度比對(duì)混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

表7 發(fā)酵時(shí)間比對(duì)混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

2.3.2 不同料水比對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由表5可知，pH值隨料水比增加而降低；乳酸桿菌活菌數(shù)在料水比為1∶0.2時(shí)最低，顯著低于其余各料水比時(shí)；酵母菌在料水比為1∶0.2時(shí)由于含水量太低，料太干不利于發(fā)酵，1∶0.6時(shí)活菌數(shù)最高，最適宜發(fā)酵，其次是料水比為1∶0.8；總酸含量在料水比為1∶0.8時(shí)最高，其次是料水比為1∶0.6和1∶1.0，均顯著高于其余兩個(gè)料水比組（P＜0.05）；酸溶蛋白含量與總酸含量規(guī)律一致。結(jié)合考慮pH值、乳酸桿菌、酵母菌活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量?jī)?yōu)先選擇料水比1∶0.6。

2.3.3 不同發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由表6可知，pH值隨發(fā)酵溫度的升高呈降低趨勢(shì)；乳酸桿菌活菌數(shù)較適發(fā)酵溫度為28～42℃，其中 32℃和37℃時(shí)活菌數(shù)最高，顯著高于其余各溫度（P＜0.05）；酵母菌活菌數(shù)以28～32℃時(shí)最高，均顯著高于其余各溫度（P＜0.05）；總酸含量以32℃和37℃時(shí)最高，其次是28℃和42℃，均顯著高于25℃和42℃（P＜0.05）；酸溶蛋白含量以32℃時(shí)最高，其次是28℃和37℃，均顯著高于25℃和42℃（P＜0.05）。綜合考慮，以溫度32℃為最適發(fā)酵溫度，其次是28℃。

2.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)混菌發(fā)酵結(jié)果的影響

在最優(yōu)的物料含水量和發(fā)酵溫度下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響如表7所示。

由表7可知，pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)；乳酸桿菌活菌數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈降低趨勢(shì)，且48h和72h時(shí)顯著高于24h時(shí)；酵母菌活菌數(shù)在48h時(shí)最高，但在72h時(shí)明顯降低一個(gè)數(shù)量級(jí)(P＜0.05)；總酸含量和酸溶蛋白含量均以48h時(shí)(P＜0.05)。因此48h為混菌發(fā)酵的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論與討論

禁抗時(shí)代的到來(lái)，發(fā)酵飼料已是大勢(shì)所趨。飼料原料經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后可產(chǎn)生動(dòng)物極易吸收的有益微生物菌體蛋白、酶類、生物活性小肽類、氨基酸、有機(jī)酸和活性益生菌等，形成營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料，能有效地促進(jìn)動(dòng)物對(duì)各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，特別是對(duì)于泌乳母豬對(duì)飼料的消化吸收和分泌乳汁具有重要作用。

本試驗(yàn)對(duì)適宜泌乳母豬全價(jià)飼料發(fā)酵的乳酸菌和酵母菌進(jìn)行了篩選，混菌發(fā)酵泌乳母豬全價(jià)料，篩選最適宜菌株，并從混菌比例、水分、溫度和時(shí)間等關(guān)鍵因素研究對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化進(jìn)行測(cè)定，以期能降低發(fā)酵飼料的生產(chǎn)成本，篩選出適宜乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論支持。用乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵泌乳母豬全價(jià)料，根據(jù)發(fā)酵前后飼料的pH值、活菌數(shù)、粗蛋白、總酸含量和酸溶蛋白含量等指標(biāo)，篩選出適宜母乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳酸桿菌和酵母菌；利用正交試驗(yàn)篩選了最優(yōu)混菌發(fā)酵組合，并從混菌比例、水分、溫度和發(fā)酵時(shí)間等關(guān)鍵因素研究對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響，篩選出適宜乳酸桿菌和酵母菌混菌發(fā)酵的最優(yōu)工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：適宜泌乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳酸桿菌為BLCC2-0015，在發(fā)酵 48h時(shí)，pH值達(dá)到4.12，活菌數(shù)為60×108CFU/g，總酸含量高達(dá)22.56 mg/g；酵母菌為BLCC4-0021，在發(fā)酵48h時(shí)活菌數(shù)為44.50×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組40.69%；兩者復(fù)配發(fā)酵最佳工藝為接種比例為BLCC2-0015：BLCC4-0021=1.5%∶1.0%、料水比為1∶0.6、發(fā)酵溫度為32℃、發(fā)酵時(shí)間48h，在此條件下，乳酸桿菌活菌數(shù)為74.53×108CFU/g，酵母菌活菌數(shù)為12.04×108CFU/g，總酸含量為18.65mg/g，酸溶蛋白含量為17.32%。