冠心病病人血漿中相關(guān)炎性因子水平及其與TIPE2的關(guān)系研究

冠心病是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的簡稱，是臨床常見的心腦血管疾病[1]。目前，冠心病的發(fā)病機制尚未完全明確，但是已經(jīng)有研究證實單核細胞趨化因子（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、可溶性血管內(nèi)皮細胞間黏附分子1（sVCAM-1）、 白細胞介素 1（IL-1）、IL-6、IL-8 等炎性因子與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。TIPE2是2008年發(fā)現(xiàn)的一種新型抗炎蛋白，能夠通過抑制炎癥反應(yīng)而對動脈粥樣硬化發(fā)揮抑制作用[3]。本研究旨在觀察冠心病病人血漿中相關(guān)炎性因子水平及其與外周血單個核細胞（PBMCs）中TIPE2之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年1月至2018年6月于我院收治的50例冠心病病人為觀察組，其中男37例，女13例，年齡 54～78歲，平均（62.42±8.66）歲；隱匿性冠心病9例，心絞痛27例，心肌梗死8例，心力衰竭及心律失常6例。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：（1）經(jīng)冠脈造影顯示，任意一支冠狀動脈管腔面積狹窄超過50%的病人；（2）來診前3個月未給予糖皮質(zhì)激素治療的病人；（3）對本次研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）未給予冠脈造影檢查的病人；（2）合并急慢性炎癥的病人；（3）合并瓣膜性心臟病的病人；（4）過敏性體質(zhì)病人；（5）合并腫瘤以及癌前病變的病人；（6）合并免疫性疾病病人；（7）合并過敏性疾病的病人；（8）合并潰瘍性結(jié)腸炎的病人。另選擇同一時期至我院進行健康體檢的健康人員50例作為對照組，其中男31例，女19例，年齡50～80歲，平均（63.77±8.29）歲。 2組病人性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集：觀察組病人在行冠脈造影前取清晨空腹靜脈血3 mL，采血管為肝素抗凝管，使用離心機3000 r／min離心15 min，吸取下層紅細胞，將剩余血液再次離心后，吸取上部大部分血漿，于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。行冠狀動脈造影的同時取動脈血3 mL，加入淋巴細胞分離液進行分離，吸取中間白膜層即為PBMCs，行TIPE2 mRNA檢測。對照組在體檢時采集清晨空腹靜脈血3 mL、橈動脈血3 mL，采集方法同觀察組。

1.2.2 炎性因子檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測血漿中 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的含量。相關(guān)試劑盒均購自R＆D公司，均由我院生化實驗室進行檢測，檢測過程嚴格按照試劑盒說明書要求操作。采用美國公司生產(chǎn)的全自動酶聯(lián)檢測儀檢測樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)公式計算樣品濃度。

1.2.3 TIPE2 mRNA檢測：采用 RT-PCR法檢測TIPE2 mRNA水平。Trizol購自美國Gibco BRL公司，Taq酶購自大連寶生物公司，模板 RNA 2μg、MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自美國Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。采用Trizol法提取組織總RNA，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min，68℃ 30 s，72℃ 40 s，共計 29個循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳60 min，使用UVIpro凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國KODAK公司）進行攝像、掃描、分析。所有操作嚴格按照說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理分析研究中的所有數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以百分（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析TIPE2 mRNA的相對表達量與相關(guān)炎性因子表達水平之間的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組相關(guān)炎性因子表達情況 觀察組病人MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見表 1。

表1 2組相關(guān)炎性因子表達情況（±s，n＝50）

表1 2組相關(guān)炎性因子表達情況（±s，n＝50）

注：與對照組比較，??P＜0.01

炎性因子 對照組 觀察組MCP-1（pg／mL） 102.47±8.22 135.72±20.56??MMP-9（pg／mL） 114.29±10.28 176.39±25.47??TNF-α（mg／mL） 20.03±2.94 25.33±5.12??sVCAM-1（pg／mL） 92.33±11.58 149.36±30.27??IL-1（pg／mL） 21.50±4.29 42.33±10.44??IL-6（pg／mL） 11.29±2.53 18.44±4.07??IL-8（pg／mL） 31.40±6.16 41.05±6.81??

2.2 2組TIPE2 mRNA的相對表達量比較 觀察組TIPE2 mRNA相對表達量為16.29±1.57，明顯低于對照組的21.33±1.37，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝17.103，P＜0.001）。2組凝膠電泳圖見圖1。

圖1 2組TIPE2凝膠電泳圖

2.3 TIPE2 mRNA的相對表達量與炎性因子的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TIPE2 mRNA的相對表達量與 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的表達水平均呈負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。 見表2。

表2 TIPE2 mRNA的相對表達量與炎性因子的相關(guān)性分析

3 討論

冠心病是臨床常見的心血管疾病，隨著人類飲食結(jié)構(gòu)的變化，冠心病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢[6]。病人以心前區(qū)壓榨性疼痛為主要臨床癥狀，發(fā)作時可伴隨呼吸急促、大汗淋漓、嘔吐甚至昏厥，具有較高的致死率，嚴重的冠心病可對病人的生存質(zhì)量造成重大影響，并帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，2009年中國城市居民冠心病死亡率為94.96／10萬，農(nóng)村為71.27／10萬[7-8]。因此冠心病的治療和預(yù)防成為臨床研究的重要課題之一。

冠心病的病因尚未完全明確，但臨床認為炎癥因子在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起到重要作用[9]。MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 等炎性因子已經(jīng)證實與冠心病密切相關(guān)[10]。MCP-1屬于趨化因子CC家族，主要在血管平滑肌細胞、血管內(nèi)皮細胞、單核細胞、巨噬細胞中表達，能夠與趨化因子受體相結(jié)合，通過細胞膜上特有的信號通路激活單核細胞或巨噬細胞，從而參與動脈粥樣斑塊的一系列炎性反應(yīng)。MMPs屬于內(nèi)肽酶家族，具有鋅離子依賴的特性[11]。MMPs是人體內(nèi)降解細胞外基質(zhì)的主要酶類，能夠?qū)δ[瘤周邊細胞所構(gòu)成的屏障進行降解，從而破壞細胞間的黏附力。MMP-9屬于MMPs中的明膠酶，被稱為明膠酶B，具有降解明膠的作用，因此在粥樣斑塊的發(fā)生中起到重要作用。TNF-α是由單核細胞和巨噬細胞合成的，具有多種生物學(xué)功能，在免疫功能調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，而且能夠通過觸發(fā)細胞因子之間的級聯(lián)反應(yīng)促使粥樣硬化的形成和發(fā)展[12]。sVCAM-1大量存在于血液中，可促進炎癥細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附，引發(fā)血管內(nèi)皮損傷，誘導(dǎo)血管收縮，增加心臟缺血缺氧。研究已經(jīng)證實sVCAM-1水平與遠期心血管不良事件的發(fā)生率呈正相關(guān)[13]。IL-1也稱為淋巴細胞刺激因子，主要由活化的單核-巨噬細胞產(chǎn)生，能夠通過促進B細胞的增殖和分泌抗體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。IL-6主要由單核-巨噬細胞、Th2細胞、血管內(nèi)皮細胞等產(chǎn)生，能夠分別刺激B細胞和T細胞活化，通常刺激肝細胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng)[14]。IL-8主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，其他細胞能夠在適宜的刺激條件下產(chǎn)生少量，已經(jīng)證實在冠心病的炎癥發(fā)展中具有重要作用。

TIPE2是一種新型的抗炎蛋白，屬于TNF-α誘導(dǎo)蛋白8家族，研究發(fā)現(xiàn)TIPE2能夠通過對T細胞受體和T細胞TOLL樣受體信號途徑進行負向調(diào)節(jié)，從而起到負性調(diào)控作用，以此維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性，實現(xiàn)機體的免疫耐受。由于TIPE2是在2008年才發(fā)現(xiàn)的新型蛋白，其研究較少，雖然已經(jīng)證實其在維持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用以及在抗動脈粥樣硬化過程中的作用，但是與冠心病病人血漿中相關(guān)炎性因子關(guān)系的研究較少。從本次研究來看，觀察組病人 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均明顯高于對照組（P＜0.01），說明上述炎癥因子在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。觀察組TIPE2 mRNA相對表達量明顯低于對照組（P＜0.05），這是因為TIPE2是通過核因子（NF）-κB信號通路維持炎性細胞因子和抗炎因子的平衡，健康人群中二者平衡比較穩(wěn)定，因此TIPE2水平較高，但是冠心病病人中這一平衡被打破，炎癥因子水平明顯升高，TIPE2水平降低。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)TIPE2的相對表達量與MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表達水平均呈負相關(guān)（P＜0.05或P＜0.01），說明 TIPE2具有抑制病人相關(guān)炎癥因子的作用。這是因為TIPE2能夠通過抑制TLR和T細胞受體的表達減少NF-κB的激活，而后者的激活是炎性因子釋放和分泌的必要途徑，因此TIPE2能夠抑制炎癥的發(fā)生，所以在本次研究中TIPE2與各種炎性因子均呈現(xiàn)出負相關(guān)。

綜上所述，冠心病病人血漿中相關(guān)炎性因子與PBMCs中TIPE2的表達呈負相關(guān)，TIPE2能通過抑制相關(guān)炎性因子的表達起到抗冠狀動脈粥樣硬化的作用，但是本次研究樣本量較小，后續(xù)仍需要大量研究來探討TIPE2在冠心病中的作用機制，從而為冠心病的預(yù)防和治療提供新途徑。