蜂毒溶血肽改善非酒精性脂肪肝大鼠肝組織脂肪沉積作用及其機(jī)制研究*

王 艷，蘇 峰，李園園，李 舒

作者單位:274300山東省單縣 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬湖西醫(yī)院消化內(nèi)科（王艷，蘇峰，李園園）；錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科（李舒）

隨著現(xiàn)代藥理學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)蜂毒溶血肽具有抗氧化和抗炎等作用[1-5]。我們觀察了蜂毒溶血肽對(duì)NAFLD模型大鼠血糖、血脂和肝功能的影響，以期為NAFLD的臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、儀器、藥品和試劑 雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【動(dòng)物許可證號(hào):SCXK（湘）2011-0003】。酶標(biāo)儀、電泳系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，電子天平購(gòu)自上海奔普儀器科技有限公司，全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自日本日立公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海光學(xué)儀器五廠有限公司。蜂毒溶血肽購(gòu)自上海熹垣生物科技有限公司。普通飼料、高脂飼料和血清檢測(cè)試劑盒、抗核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子 2（Nrf2）、抗血紅素加氧酶-1（HO-1）和抗3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）均購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 NAFLD大鼠模型的構(gòu)建 取40只大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組、模型組、小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組。在對(duì)照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，給予其他三組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)，構(gòu)建NAFLD大鼠模型。在高脂飼料喂養(yǎng)4 w后，分別給予蜂毒溶血肽10 μg·kg-1·d-1和100μg·kg-1·d-1皮下注射，在對(duì)照組和模型組，則給予同等量的生理鹽水皮下注射。連續(xù)給藥12 w后，常規(guī)行肝組織學(xué)檢查。

1.3 血清學(xué)檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用ELISA法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平。

1.4 大鼠肝臟組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)，簡(jiǎn)要步驟如下:取大鼠肝臟組織，剪碎，加入裂解液裂解，沸水浴下使蛋白變性，采用BCA法檢測(cè)蛋白定量，行SDS凝膠電泳，以β-actin作為內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，應(yīng)用Image J圖像處理軟件計(jì)算各條帶吸光度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，以（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn)情況 模型組大鼠肝細(xì)胞大小不一，胞內(nèi)存在大小不等的脂肪顆粒沉積，小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；小劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝內(nèi)脂肪顆粒堆積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，而大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝細(xì)胞排列整齊，未見脂肪顆粒堆積和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1）。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量均有不同程度的下降（P＜0.05），而大劑量蜂毒溶血肽處理組動(dòng)物體質(zhì)量和肝質(zhì)量下降更為明顯（表 1）。

2.2 各組大鼠血清AST和ALT水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清AST和ALT水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血清AST和ALT水平下降更為明顯（表2）。

2.3 各組大鼠血糖和血脂水平比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血糖、TC、TG和LDL-C水平均有不同程度的下降（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血糖、TC、TG和LDL-C水平下降更為明顯（表3）。

2.4 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清SOD和GSH水平均有不同程度的升高（P＜0.05），MDA水平有不同程度的降低（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組血清SOD和GSH水平升高，而MDA水平下降更為明顯（表4）。

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況的比較 與模型組比，小劑量和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)均有不同程度的增強(qiáng)（P＜0.05），大劑量蜂毒溶血肽處理組肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)更為明顯（圖2，表5）。

圖1 四組大鼠肝組織學(xué)表現(xiàn) （HE，400×）

表1 四組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量（±s）比較

表1 四組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

只數(shù) 體質(zhì)量（g） 肝質(zhì)量（g）對(duì)照組 10 368.0±23.6 8.8±0.7模型組 10 435.2±22.1 14.3±1.4小劑量蜂毒溶血肽 10 398.7±19.5 12.2±1.4大劑量蜂毒溶血肽 10 380.2±20.8 10.4±1.3

表2 四組大鼠血清AST和ALT水平（±s）比較

表2 四組大鼠血清AST和ALT水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) AST（U/L） ALT（U/L）對(duì)照組 10 29.2±5.4 42.3±5.5模型組 10 159.7±18.9 77.7±6.8小劑量蜂毒溶血肽 10 122.6±14.5 69.4±7.0大劑量蜂毒溶血肽 10 88.0±10.4 49.3±6.2

表3 四組大鼠血糖和血脂水平（±s）比較

表3 四組大鼠血糖和血脂水平（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) 血糖（mmol/L） TC（mmol/L） TG（mmol/L） LDL-C（mmol/L）對(duì)照組 10 4.8±0.6 1.1±0.1 0.6±0.1 0.1±0.1模型組 10 18.3±2.4① 2.8±0.3① 1.5±0.2① 0.5±0.1①小劑量蜂毒溶血肽 10 15.4±2.0①② 2.4±0.3①② 1.2±0.1①② 0.4±0.1①②大劑量蜂毒溶血肽 10 8.7±1.8①② 1.6±0.2①② 0.8±0.1①② 0.3±0.1①②

表4 四組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)（±s）比較

表4 四組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) SOD（U/L）對(duì)照組 10 95.2±8.7模型組 10 30.4±5.3①小劑量蜂毒溶血肽 10 46.7±4.9①②大劑量蜂毒溶血肽 10 82.1±6.6①②MDA（nmol/mL）4.2±0.5 13.1±1.6①10.8±1.4①②6.3±0.8①②GSH（mmol/L）9.2±1.4 2.3±0.5①4.1±0.5①②8.7±0.9①②

圖2 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況

表5 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（±s）比較

表5 四組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)（±s）比較

與對(duì)照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

例數(shù) Nrf2 HO-1對(duì)照組 10 1.5±0.2 1.3±0.1模型組 10 0.3±0.1① 0.3±0.1①小劑量蜂毒溶血肽 10 0.7±0.1①② 0.8±0.1①②大劑量蜂毒溶血肽 10 1.4±0.2② 1.2±0.1②

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂飼料喂養(yǎng)造模，通過檢測(cè)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、血糖、血脂和肝功能指標(biāo)，觀察大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)變化，確定NAFLD大鼠是否造模成功，驗(yàn)結(jié)果表明，通過喂養(yǎng)高脂飼料，模型組大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量、血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平均較對(duì)照組升高，且通過肝組織觀察到模型組大鼠肝組織肝細(xì)胞大小不一，細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂肪顆粒沉積，組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明NAFLD大鼠造模成功。

目前，臨床主要采取控制飲食、增加運(yùn)動(dòng)量和服用藥物等對(duì)NAFLD患者進(jìn)行干預(yù)[6-10]。其中，治療藥物主要為降脂藥物和護(hù)肝藥物等，其效果只能暫時(shí)調(diào)節(jié)NAFLD患者血糖、血脂和肝功能指標(biāo)，治療過程較長(zhǎng)[11-13]。因此，尋找針對(duì)NAFLD治療的特效藥物勢(shì)在必行。蜂毒溶血肽是由蜜蜂毒腺分泌的一種多肽類物質(zhì)，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[14，15]。在NAFLD大鼠皮下注射蜂毒溶血肽干預(yù)12周，發(fā)現(xiàn)大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量均較模型組大鼠降低，血糖、血清 TC、TG、LDL-C、AST 和 ALT 水平也降低，表明蜂毒溶血肽對(duì)NAFLD大鼠有治療作用，且隨著蜂毒溶血肽給藥劑量的增加，效果也越明顯。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激反應(yīng)能促進(jìn)NAFLD的發(fā)生和發(fā)展[16]。當(dāng)肝臟抗氧化作用超出正常能力時(shí)，肝臟就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大量的過氧化物生成，損傷肝臟細(xì)胞[17，18]。Nrf2/HO-1通路主要調(diào)控機(jī)體抗氧化能力[19]。促進(jìn)Nrf2/HO-1通路激活，可有效提高機(jī)體抗氧化能力，避免氧化應(yīng)激帶來的損傷[20]。本研究對(duì)蜂毒溶血肽干預(yù)NAFLD大鼠的作用機(jī)制進(jìn)行了初探，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組比，小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠血清SOD、GSH水平均有不同程度的升高，而MDA水平降低。大劑量蜂毒溶血肽處理組血清SOD和GSH水平升高，MDA水平下降更為明顯。與模型組比，小劑量蜂毒溶血肽處理組和大劑量蜂毒溶血肽處理組大鼠肝組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而以大劑量蜂毒溶血肽處理組更為明顯。以上結(jié)果表明蜂毒溶血肽可促進(jìn)Nrf2/HO-1通路激活，提升動(dòng)物血清SOD和GSH水平，降低MDA水平，進(jìn)而保護(hù)肝臟，減輕脂肪變程度。

綜上所述，蜂毒溶血肽對(duì)NAFLD大鼠肝臟有保護(hù)作用，可能是通過調(diào)控Nrf2/HO-1通路，促進(jìn)了大鼠的抗氧化能力。由于肝脂肪變的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，可能涉及多個(gè)通路的激活和細(xì)胞因子的參與。