苦參素對(duì)大鼠全腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

外科手術(shù)、心臟驟停、窒息等導(dǎo)致低壓、低氧常引發(fā)全腦缺血[1]，目前臨床以藥物或介入手術(shù)溶栓為主要治療方案，但再灌注損傷極大地影響病人預(yù)后，其機(jī)制與炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡有關(guān)[2-3]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，苦參素為喹諾西啶類生物堿，是一類具有抗炎、抗凋亡活性的中藥提取物[4-5]，但苦參素對(duì)全腦缺血再灌注損傷影響的相關(guān)報(bào)道較少，本研究探討苦參素對(duì)大鼠全腦缺血再灌注后腦組織的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD大鼠(雌雄不限)由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(冀)2013-1-003]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 苦參素(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20170114)；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒和末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：170129、170312、170116、170324；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170309、20170413、20170114。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組、給藥與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(0.9%氯化鈉溶液)、模型組(0.9%氯化鈉溶液)和苦參素低劑量組[25 mg/(kg·d)]、中劑量組[50 mg/(kg·d)]、高劑量組[100 mg/(kg·d)]，每組20只。術(shù)前10 min腹腔注射相應(yīng)濃度藥物，實(shí)施麻醉后通過夾閉四動(dòng)脈(雙側(cè)椎動(dòng)脈和雙側(cè)頸動(dòng)脈)制備全腦缺血大鼠模型，造模成功標(biāo)志：腦電圖波幅下降正常25%以下、翻正反射消失、瞳孔顏色變灰白，夾閉四動(dòng)脈20 min；假手術(shù)組不夾閉四動(dòng)脈，其余操作同模型組[6]。

1.3.2 翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間記錄 應(yīng)用BL-420E型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠翻正反射恢復(fù)時(shí)間；記錄腦電振幅恢復(fù)到正常75%時(shí)間，即腦電恢復(fù)時(shí)間。

1.3.3 腦組織含水量 各組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后取腦并去除小腦和腦干，稱重為濕重；用錫紙包裹后置110 ℃干燥箱烘烤至恒重，稱重為干重，腦組織含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.3.4 海馬CA1區(qū)病理學(xué)檢查及神經(jīng)元凋亡觀察 每組隨機(jī)取6只大鼠，麻醉后取腦并去除小腦和腦干后置于濃度4%多聚甲醛溶液固定72 h，之后進(jìn)行石蠟包埋和切片，切片厚度約2 μm，經(jīng)二甲苯透明、脫蠟水化處理后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，梯度乙醇脫水后封片，最后通過光學(xué)顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)組織細(xì)胞病理學(xué)改變。取石蠟切片并脫蠟水化處理后，按照TUNEL試劑盒操作說明步驟進(jìn)行，通過光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡狀況，計(jì)算視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，每張切片均取5個(gè)不重疊的視野并分別計(jì)數(shù)后取平均值，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.5 海馬組織炎癥細(xì)胞因子含量、抗氧化酶活性和MDA含量 取各組剩余8只大鼠，麻醉后取腦組織并剝?nèi)『ｑR組織，于冰上剪碎后加入適量冷裂解液后行研磨勻漿，4 ℃條件下，12 000 r/min離心，取上清液，之后按照各試劑盒操作方法測(cè)定炎癥細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量和抗氧化酶SOD、CAT活性和MDA含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間、腦含水量比較 與模型組比較，苦參素中劑量組、高劑量組翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間均顯著縮短(P<0.01)。模型組腦組織翻正反射恢復(fù)時(shí)間、腦電恢復(fù)時(shí)間和腦含水量較假手術(shù)組顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，苦參素中、高劑量組腦含水量顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間、腦含水量比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組未見異常；模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少、排列稀疏、層次紊亂，胞體腫脹或空泡變性，核固縮或溶解、核膜不清等病理性改變；苦參素干預(yù)能改善全腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變，以高劑量組最顯著。詳見圖1。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為苦參素低劑量組；D為苦參素中劑量組；E為苦參素高劑量組

圖1各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×400)

2.3 海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況 假手術(shù)組僅見少量凋亡神經(jīng)元；模型組凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯多于假手術(shù)組；與模型組比較，苦參素能減少神經(jīng)元凋亡，以高劑量組最顯著。詳見圖2。模型組AI高于假手術(shù)組[(64.8±8.3)%與(2.3±0.9)%，P<0.01]；與模型組比較，苦參素中、高劑量組AI明顯降低[(41.2±7.0)%、(15.8±3.6)%與(64.8±8.3)%，P<0.01]。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為苦參素低劑量組；D為苦參素中劑量組；E為苦參素高劑量組

圖2各組大鼠大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況(TUNEL，×400)

2.4 各組大鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子含量比較 模型組炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量較假手術(shù)組均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，苦參素中劑量組、高劑量組炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

2.5 各組大鼠海馬組織抗氧化酶活性和MDA含量比較 模型組抗氧化酶(SOD、CAT)活性較假手術(shù)組降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)；與模型組比較，苦參素中劑量組、高劑量組SOD、CAT活性增高且MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表2 各組大鼠海馬組織炎癥細(xì)胞因子含量比較(±s) nmol/L

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

表3 各組大鼠海馬組織抗氧化酶活性和MDA含量比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

氧化應(yīng)激、炎癥及神經(jīng)元凋亡在再灌注損傷發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3，7]，其作為靶點(diǎn)已成為防治缺血再灌注損傷新型藥物研發(fā)熱點(diǎn)。苦參素是中藥苦參的主要有效成分之一，王雪芬等[8]研究發(fā)現(xiàn)苦參素具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)的藥理學(xué)作用，苦參素通過抑制氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[8-9]；賈昌盛等[10]研究發(fā)現(xiàn)苦參素通過調(diào)控機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對(duì)腎臟缺血-再灌注損傷起到一定保護(hù)作用；高鵬[11]研究發(fā)現(xiàn)苦參素通過抑制細(xì)胞凋亡而保護(hù)肝臟缺血再灌注。既往關(guān)于苦參素對(duì)全腦缺血再灌注損傷影響文獻(xiàn)的報(bào)道尚不多見。

本研究采用與人類病理特點(diǎn)接近的四動(dòng)脈夾閉法制備全腦缺血再灌注大鼠模型[12]展開研究，海馬是對(duì)腦缺血最敏感的區(qū)域之一，尤其是CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層[13]，因此本研究以大腦海馬CA1區(qū)為組織損傷及改善觀察區(qū)域。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量苦參素預(yù)處理能有效縮短翻正反射和腦電恢復(fù)時(shí)間、降低腦組織含水量、抑制海馬CA1區(qū)病變并抑制該區(qū)域神經(jīng)元凋亡，提示苦參素對(duì)全腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

氧自由基代謝失衡是導(dǎo)致細(xì)胞膜不飽和脂肪酸氧化破壞等氧化應(yīng)激損傷的根源，其代謝失衡，在體內(nèi)蓄積與抗氧化酶(SOD、CAT)過度消耗有關(guān)[14]；MDA為不飽和脂肪酸氧化應(yīng)激損傷終產(chǎn)物之一，其含量間接反映氧化應(yīng)激損傷程度[15]。炎癥細(xì)胞因子是臨床監(jiān)測(cè)炎癥反應(yīng)的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量苦參素預(yù)處理能有效提高海馬組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6含量，提示苦參素對(duì)全腦缺血再灌注損傷后氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。

綜上所述，苦參素對(duì)全腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。