馬 金丁春華張敏州
5%~23%的心肌梗死(myocardial infarction,MI)病人可伴發(fā)心房顫動。Framingham心臟中心研究顯示,MI合并心力衰竭可使女性病人心房顫動發(fā)生風(fēng)險增加4.5倍,男性病人心房顫動發(fā)生風(fēng)險增加5.9倍[1]。近年來,心房纖維化作為心房顫動的重要發(fā)病機制之一,在心房顫動中的作用越來越受到重視[2]。MI后由于交感神經(jīng)系統(tǒng)長期過度興奮,腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活,心臟局部和血液血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)水平升高,均可導(dǎo)致心房纖維化及結(jié)構(gòu)重構(gòu),從而使心房顫動易于發(fā)生[3]。
丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA,Tan ⅡA)具有多種心血管藥理活性,可降低心肌缺血再灌注損傷所致的心律失常, Tan ⅡA注射液可減少急性心肌梗死并發(fā)心房顫動。相關(guān)實驗證實,Tan ⅡA具有抑制心肌細胞外基質(zhì)中膠原和彈力蛋白的沉積,減少纖維化的作用[3-4]。Tan ⅡA是否通過抑制心房纖維化防治MI后心房顫動尚不清楚。本研究利用大鼠MI模型,采用經(jīng)食管高頻起搏左房技術(shù)檢測心房顫動的誘發(fā)率,明確Tan ⅡA是否具有降低MI后心房顫動誘發(fā)率的作用。
1.1 主要試劑 Tan ⅡA購自大連美侖生物技術(shù)公司;羥脯氨酸測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購自英國Abcam公司。
1.2 主要儀器 PowerLab型多導(dǎo)生理信號采集分析系統(tǒng),澳大利亞ADinstruments公司;ISO-Flex型電生理刺激隔離器,以色列AMPI公司;Vevo2100型動物超高分辨率超聲系統(tǒng),加拿大VisualSonic公司;Epoch型微孔板分光光度計,美國Biotek儀器有限公司。
1.3 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠40只,體重250~280 g,購自南方醫(yī)科大學(xué)動物中心,許可證號:SCXK(粵)2011-0029,大鼠專用飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。所有實驗方法和步驟均符合實驗守則和倫理委員會的要求。實驗分為假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死組(MI組)和丹參酮ⅡA組(Tan ⅡA組)。由于大鼠MI模型初始1周死亡率較高,所以30只造模,10只死亡,造模1周后將存活的20只大鼠隨機分為MI組和TanⅡA組。Sham組由于未造模,死亡率為0,最終30只大鼠存活納入實驗。
1.4 大鼠MI模型制備 MI模型采用左冠狀動脈前降支(LAD)結(jié)扎制備[5]:大鼠麻醉后無創(chuàng)氣管插管連接呼吸機,開胸暴露心臟,將LAD結(jié)扎。通過肉眼觀察(顏色變蒼白)和心電圖監(jiān)測(ST段抬高和QRS增寬)證實結(jié)扎成功。MI術(shù)后1周大鼠經(jīng)動物超聲檢查左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),將LVEF<45%的大鼠納入實驗,作為MI并發(fā)心力衰竭模型(其余排除本實驗)。Sham組接受同樣的手術(shù)過程,但LAD只穿線不結(jié)扎。Tan ⅡA組大鼠灌胃Tan ⅡA 70 mg/(kg·d),Sham組、MI組給予等體積的0.5%羥甲纖維素替代,共給藥4周。
1.5 心房顫動誘發(fā)率及持續(xù)時間的檢測 參考文獻[5-6],采用經(jīng)食管高頻起搏左心房方法誘發(fā)心房顫動。大鼠麻醉后固定,連接四肢監(jiān)測心電。無創(chuàng)氣管插管并連接呼吸機人工通氣,通過食管插入4F四極電極至左心房后壁處,經(jīng)食管導(dǎo)聯(lián)心電圖調(diào)整電極深度,待出現(xiàn)負正雙相P波時,將導(dǎo)線連接電生理刺激隔離器,測定起搏閾值,起搏電流以2倍起搏閾值電流,確認1∶1起搏后予以固定。心房顫動誘發(fā)電刺激方案:經(jīng)食管電極發(fā)放S1,S1刺激35 s,起搏間期5 ms,觀察心房顫動誘發(fā)情況。以心房顫動持續(xù)時間≥2 s作為誘發(fā)成功標(biāo)志;若未誘發(fā)出心房顫動,則重復(fù)刺激2次;若仍未成功,起搏電流依次遞增2次,每個強度均重復(fù)3次,仍未誘出者,視為心房顫動誘發(fā)不成功。分析心房顫動誘發(fā)率和心房顫動持續(xù)時間的變化。
1.6 羥脯氨酸含量檢測 取左心房組織,按照羥脯氨酸測定試劑盒說明書步驟操作,采用酶標(biāo)儀檢測各組上清液550 nm處吸光度值。
1.7 組織病理學(xué)觀察 心臟多聚甲醛固定后,沿心底到心尖部取心臟縱切面4 μm連續(xù)切片,常規(guī)脫蠟,采用Masson染色方法,心肌纖維染色呈綠色,間質(zhì)膠原呈紅色。每張切片隨機取5個高倍視野,用圖像分析軟件分析測定心肌纖維化面積百分比(膠原面積÷心肌總面積×100%),可反映心房間質(zhì)纖維化程度。
1.8 Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1蛋白含量檢測 采用Western Blot檢測左心房Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1含量。具體步驟如下:加入預(yù)冷的含cocktail蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA,CST)在液氮內(nèi)研磨制成勻漿,12 000 r/min離心30 min,取上清液,二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白質(zhì)定量。取50 μg總蛋白樣品于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜,用5%脫脂牛奶封閉后,用Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、MMP-9和TIMP-1相應(yīng)抗體1∶1 000,4 ℃孵育過夜。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育40 min,顯色。GAPDH(1∶1 000)作為內(nèi)參,增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)曝片。采用Image J 軟件分析蛋白條帶,以目的條帶和GAPDH條帶灰度值之比評價蛋白表達水平。
2.1 心房顫動誘發(fā)率和持續(xù)時間 經(jīng)食管高頻起搏左心房方法誘導(dǎo)心房顫動,圖1 A為典型的誘發(fā)心房顫動心電圖,電刺激前為竇性心律;電刺激結(jié)束后心電圖P波消失,代之f波,RR間期絕對不等,誘發(fā)出心房顫動;經(jīng)過若干秒后,心房顫動自發(fā)轉(zhuǎn)復(fù)為竇性心律并維持。MI組發(fā)生心房顫動11例,心房顫動誘發(fā)率73.3%(11/15),Sham組未誘發(fā)出心房顫動(0/15)。Tan ⅡA組心房顫動誘發(fā)率為46.7%(7/15),低于MI組的73.3%,詳見圖1 B。Tan ⅡA組心房顫動持續(xù)時間為62~238 s,短于MI組(397~656 s),詳見圖1 C。
圖1 經(jīng)食管高頻起搏左心房方法檢測心房顫動易感性
2.2 心房病理學(xué)觀察結(jié)果 Masson染色檢測結(jié)果顯示,心肌細胞染成綠色,間質(zhì)膠原蛋白染成紅色。MI組間質(zhì)紅色膠原蛋白區(qū)域較Sham組明顯增加,其心肌纖維化面積百分比可達9.5%;Sham組未見明顯的紅色膠原蛋白區(qū)域。Tan ⅡA組纖維化區(qū)域相對于MI組縮小,其纖維化面積較MI組顯著降低。詳見圖2。
圖2 Masson染色檢測左心房纖維化情況(×200)
與Sham組比較,*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05
2.3 心房羥脯氨酸含量 ELISA檢測結(jié)果顯示,MI組左心房羥脯氨酸含量顯著高于Sham組(P<0.05),Tan ⅡA組羥脯氨酸含量低于MI組(P<0.05)。詳見圖3。
與Sham組比較,*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05
2.4 心房膠原蛋白含量 Western Blot檢測結(jié)果顯示,MI組左心房Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量高于Sham組(P<0.05),Tan ⅡA組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量低于MI組(P<0.05)。詳見圖4。
與Sham組比較,*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05
2.5 心房MMP-9、TIMP-1蛋白含量 Western Blot檢測結(jié)果顯示,MI組左心房MMP-9蛋白含量高于Sham組(P<0.05),TIMP-1蛋白含量低于Sham組(P<0.05),MMP-9/TIMP-1比值增大。Tan ⅡA組MMP-9蛋白含量下調(diào),低于MI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);TIMP-1蛋白含量上調(diào),高于于MI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Tan ⅡA組MMP-9/TIMP-1比值下降,低于MI組。詳見圖5。
與Sham組比較,*P<0.05;與MI組比較,#P<0.05
Tan ⅡA是中藥丹參的主要有效成分,其磺化劑注射液現(xiàn)已廣泛用于心絞痛、腦卒中、腫瘤、肝纖維化等多種疾病的臨床治療[6]。近些年關(guān)于Tan ⅡA抑制心室重構(gòu)進行了大量研究,認為其對多種心血管疾病所致心室重構(gòu)均有一定治療作用,機制包括:改善心肌肥大,減少心肌細胞凋亡,抑制心肌細胞外基質(zhì)膠原沉積及改善心臟神經(jīng)重構(gòu)和電生理異常等。劉莉娟等[7]報道胺碘酮聯(lián)合丹參酮ⅡA磺酸鈉治療MI并發(fā)心房顫動效果顯著。本研究采用大鼠MI模型,造模1周后給藥避免了藥物對MI急性期的保護作用,單獨研究藥物對MI慢性期作用,證實Tan ⅡA具有抑制MI后左心房纖維化并降低心房顫動易感性的作用。
心肌纖維化是臨床多種心血管疾病發(fā)展到終末階段的必然過程[8-9]。Kim等[10]研究發(fā)現(xiàn)大鼠MI慢性期存在明顯的左房纖維化,大鼠MI 10周后左房纖維化面積較對照組增加近10倍。心房纖維化是導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)、電傳導(dǎo)及興奮性改變,引起及維持心房顫動的充分條件[11]。心房纖維化開始于基礎(chǔ)疾病早期并一直持續(xù)發(fā)生,導(dǎo)致心房結(jié)構(gòu)改變。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),具有抗纖維化作用的藥物吡格列酮、白藜蘆醇等均可減少心房纖維化,改善心房電傳導(dǎo)功能,有效降低心房顫動發(fā)生[12-13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),MI組左心房膠原纖維化面積及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量明顯高于Sham組,并伴有心房顫動誘發(fā)率和心房顫動持續(xù)時間明顯增高,Tan ⅡA組左心房膠原纖維化面積較MI組減少,Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量較MI組降低,證明Tan ⅡA具有抑制心房纖維化作用,并降低心肌梗死大鼠心房顫動誘發(fā)率和持續(xù)時間,證明Tan ⅡA可有效降低MI后心房顫動易感性。
生理情況下,細胞外基質(zhì)(ECM)生成和降解處于動態(tài)平衡。各種因素引起生成和降解失衡,導(dǎo)致ECM聚集是心肌纖維化的重要機制[14]。MMPs是唯一能降解心肌間質(zhì)膠原的一類鋅依賴蛋白酶,TIMPs是內(nèi)源性MMPs抑制劑,MMPs選擇性地消化分解細胞外基質(zhì)的各種成分,與TIMPs二者相互作用保持相對平衡,控制調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)組織膠原的生成代謝和更新[15]。MMP-9/TIMP-1在該過程中發(fā)揮重要作用。有研究證明,心肌纖維化過程伴有MMP-9/TIMP-1活性或表達異常[16]。兩者決定心臟基質(zhì)合成與降解的平衡,在維持心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性方面起重要作用[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),心肌梗死后,左心房MMP-9蛋白表達上調(diào),TIMP-1蛋白表達下調(diào),MMP-9/TIMP-1比值升高,這與既往研究結(jié)果[18-19]一致。Tan ⅡA組給藥4周后,左心房MMP-9蛋白表達較MI組降低,TIMP-1蛋白表達量較MI組升高,MMP-9/TIMP-1比值較MI組降低,心房纖維蛋白量降低。因此,推測Tan ⅡA減輕心房細胞外間質(zhì)纖維化作用,與MMP-9/TIMP-1表達平衡有關(guān),可能通過影響MMP-9和TIMP-1表達,是兩者表達平衡減輕心肌細胞外間質(zhì)重構(gòu)。
綜上所述,Tan ⅡA具有抑制心房纖維化并降低心肌梗死后心房顫動易感性的作用,這可能與Tan ⅡA具有調(diào)節(jié)MMP-9/TIMP-1平衡作用有關(guān)。