MTHFR基因多態(tài)性與深靜脈血栓形成及血瘀積分的相關(guān)性分析

駱珍玉23方主亭王 沆丁 航駱杰偉

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)形成指深靜脈血液出現(xiàn)異常凝聚致使靜脈內(nèi)血液不能正常回流的一系列疾病，常導(dǎo)致血栓后綜合征(PTS)，病情嚴重者影響生活質(zhì)量，甚至導(dǎo)致死亡。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)發(fā)生變異，引起血同型半胱氨酸(Hcy)代謝通路發(fā)生障礙，Hcy堆積，產(chǎn)生一系列心腦血管病理改變，是以MTHFR基因錯義突變作為誘發(fā)相關(guān)心腦血管疾病的諸多可能因素之一[1]，DVT基因檢測的個體化與中醫(yī)證候的多樣性及繁復(fù)性一致，部分靶向基因檢測已逐漸應(yīng)用于臨床，但基因多態(tài)性與中醫(yī)證候的相關(guān)性研究處于初級階段。本研究前瞻性分析福建地區(qū)MTHFR基因多態(tài)性、DVT形成及Hcy之間關(guān)系，并探討其多態(tài)性及血Hcy水平與血瘀證候表型的關(guān)系，為DVT形成機制及防治提供思路與理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 診斷標準 DVT診斷標準：參照2012年DVT的診斷和治療指南[2]；中醫(yī)血瘀證診斷標準：參照2016年實用血瘀證診斷標準[3]制定。

1.2 納入標準 DVT組：符合診斷DVT診斷標準，根據(jù)中醫(yī)血瘀證診斷標準診斷為血瘀證，研究對象之間不存在血緣關(guān)系，且長期居住于福建省，研究對象知情同意，并簽署相關(guān)知情同意書。對照組：體格檢查、心電圖(ECG)、血常規(guī)、凝血系列、肝腎功能等臨床生化指標及中醫(yī)望、聞、問、切四診均無明顯異常體檢者，且研究對象之間不存在血緣關(guān)系，長期居住于福建省，研究對象知情同意，簽署相關(guān)知情同意書。

1.3 排除標準 DVT組：嚴重或惡性貧血、血小板增多癥及抗磷脂綜合征、原發(fā)性腎臟疾病、動靜脈瘺、自身免疫相關(guān)性疾病等全身其他組織器官或系統(tǒng)性重大疾??；嚴重急性感染；孕產(chǎn)期及口服避孕藥女性；根據(jù)中醫(yī)血瘀證診斷標準診斷為非血瘀證；不能配合信息采集或精神病病人。對照組：根據(jù)中醫(yī)血瘀證診斷標準診斷為血瘀證；孕產(chǎn)期及口服避孕藥者；不能配合信息采集或精神病病人。

1.4 一般資料 符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)基本原則，收集2016年1月—2017年1月在福建省立醫(yī)院就診并且符合相關(guān)納入和排除標準的DVT病人168例，男92例，女76例；年齡(60.58±13.30)歲；評價DVT病人血瘀證候積分，按血瘀程度分組，輕度血瘀證85例，中度血瘀證73例，重度血瘀證10例。同期收集福建省立醫(yī)院健康體檢者159名作為對照組，男78名，女81名，年齡(59.38±13.26)歲。

1.5 相關(guān)指標及方法 以問診形式收集臨床基線資料，采用統(tǒng)一規(guī)范的血瘀證診斷標準信息采集表，按照中醫(yī)傳統(tǒng)四診方法予以采集病情資料，并做好記錄。雙試劑循環(huán)酶法檢測血漿Hcy水平。根據(jù)北京天根血液基因組DNA提取試劑盒提取方法進行基因組DNA提取，Primer5.0 Input軟件自行設(shè)計MTHFR基因引物，進行MTHFR基因聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，直接檢測法檢測MTHFR基因型。

2 結(jié) 果

2.1 兩組臨床資料比較 DVT組與對照組血Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)，并對DVT組病人進行血瘀積分計分，結(jié)果血瘀積分值為14.00(6.00，20.00)。詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 基因測序圖 MTHFR存在(ttgaaggagaaggtgtctgcgggag[c/t]cgatttcatcatcacgcagcttttc)C677T多態(tài)性，677C→T，導(dǎo)致堿基編碼的丙氨酸(Ala)被替換為纈氨酸(Val)，改變相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進而改變MTHFR活性。MTHFR基因經(jīng)測序得到CC、CT、TT 3種基因類型，分別為圖A、B、C，箭頭指向為位點突變位置堿基。詳見圖1。

圖1 MTHFR C677T基因型的測序圖

2.3 MTHFR基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 兩組MTHFR基因進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗，MTHFR基因的基因型分布頻率預(yù)計值及觀測值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與Hardy-Weinberg遺傳平衡定律相符合(DVT組χ2=0.980，P=0.320；對照組χ2=0.003，P=0.960)。說明本研究人群達到遺傳平衡，具有一定的群體代表性。詳見表2。

表2 MTHFR基因的Hardy-Weinberg平衡定律檢驗 例(%)

2.4 DVT組與對照組MTHFR C677T基因多態(tài)性基因型比較 兩組MTHFR基因型總分布頻率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.694，P=0.008)，進一步χ2分割檢驗提示：DVT組CT+TT頻率(44.05%)高于對照組的(29.56%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.355，P=0.007)。

2.5 DVT組不同MTHFR基因類型血Hcy水平比較 不同基因類型Hcy比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.478，P=0.001)；再進一步對不同基因類型之間Hcy進行兩兩比較，結(jié)果顯示：DVT組MTHFR基因CC型與CT型、CC型與TT型、CT型與TT型Hcy比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.374，P=0.018；Z=-3.367，P=0.001；Z=-2.219，P=0.026)。詳見表3。

2.6 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型血瘀程度比較 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型不同血瘀程度人數(shù)構(gòu)成比不同，含等位基因T的中度、重度血瘀證人數(shù)構(gòu)成比高于CC型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.792，P=0.020)。詳見表4。

表3 DVT組不同MTHFR基因類型血Hcy水平比較 μmol/L

表4 DVT組MTHFR基因CC型與CT+TT型血瘀程度比較 例(%)

2.7 DVT組不同血瘀程度分級與血Hcy水平比較 DVT組輕度血瘀證85例，中度血瘀證73例，重度血瘀證10例，因重度血瘀證病人僅10例，病例數(shù)較少，數(shù)據(jù)統(tǒng)計易發(fā)生偏移，故與中度血瘀證合并為一類進行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。輕度血瘀證血Hcy水平低于中度+重度血瘀證，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.571，P<0.001)。詳見表5。

表5 DVT組不同血瘀程度分級與血Hcy水平比較 μmol/L

注：Z=-3.571，P<0.001

2.8 DVT組血瘀積分與血Hcy水平相關(guān)性分析 應(yīng)用Pearson相關(guān)分析及偏相關(guān)分析DVT組Hcy水平與血瘀證候積分的相關(guān)性，將年齡作為控制條件。未控制年齡的影響，血瘀證候積分與血Hcy水平呈正相關(guān)(r=0.256，P=0.001)；控制年齡影響因素后，血瘀證候積分與血Hcy水平呈正相關(guān)(r=0.264，P=0.001)。提示血瘀證候積分與血Hcy水平之間存在呈正相關(guān)。

2.9 DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析 對DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析，二項為DVT組與對照組兩個組別，以對照組為參照，以是否患有DVT為因變量(DVT組=1，對照組=0)，以MTHFR-CC/CT+TT型、Hcy、性別、體質(zhì)指數(shù)、年齡、飲酒、吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥、癌癥、手術(shù)史及靜脈曲張為自變量，MTHFR-CC/CT+TT型、Hcy、高血壓、癌癥、靜脈曲張為DVT的危險因素(P<0.05)。調(diào)整混雜因素后，MTHFR-CC/CT+TT型的相對危險度(OR=1.798，95%CI：1.082～2.988，P=0.024)，Hcy的相對危險度(OR=1.059，95%CI：1.004～1.118，P=0.036)。詳見表6。

表6 DVT病人的多因素二項Logistic回歸分析

3 討 論

MTHFR是Hcy代謝過程中一種關(guān)鍵的限速酶，Goyette等[4]首次克隆出人的MTHFR cDNA，MTHFR基因位于1 p36.3染色體區(qū)，編碼區(qū)長度1.98 kb，cDNA長度為2.2 kb，11個外顯子在102～432 bp，10個內(nèi)含子在250～1 500 bp。該基因常存在遺傳變異與基因多態(tài)性，目前發(fā)現(xiàn)的突變位點有20多個，其中MTHFR基因C677T突變較常見，F(xiàn)rosst等[5]最先發(fā)現(xiàn)該突變位點，MTHFR基因的第677個核苷酸位點上，堿基胞嘧啶C被堿基胸腺嘧啶T替換，使其編碼的高度保守氨基酸丙氨酸(Ala)被替換成為纈氨酸(Val)，降低黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和MTHFR的結(jié)合能力，進而降低MTHFR酶的活性與熱穩(wěn)定性，雜合突變MTHFR酶活性下降至71%，純合突變MTHFR酶活性只有約34%。本研究提示攜帶有MTHFR基因CT/TT基因型及高Hcy是DVT形成的危險因素，且可能是DVT血瘀證形成的易感因素之一，與相關(guān)報道[6-7]相符，其機制可能是：MTHFR基因缺陷引起多個基礎(chǔ)生化過程發(fā)生紊亂，進而產(chǎn)生諸多心血管病證，其中MTHFR基因C677T突變引起DVT機制復(fù)雜，其基因突變導(dǎo)致的高Hcy與血栓形成關(guān)系密切，高Hcy損傷血管內(nèi)皮及平滑肌細胞，破壞內(nèi)皮功能及完整性，血小板在血管腔內(nèi)聚集率增加，誘發(fā)相關(guān)血管的粥樣硬化及血栓形成[8]。Qian等[9]發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T與動脈粥樣硬化之間存在明顯相關(guān)性，高Hcy致使脂質(zhì)代謝紊亂，加速氧化，損傷血管內(nèi)皮，血管壁增厚促使血管狹窄。Hcy呈濃度依賴性促進細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，抑制超氧化物歧化酶及谷胱甘肽水平，使抗氧化物的活性降低，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。進一步抑制精氨酸轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致L-精氨酸缺乏，使一氧化氮(NO)形成減少，還可能產(chǎn)生內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的解偶聯(lián)[10]。同時誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)表達，增加細胞內(nèi)鈣離子濃度，與血管平滑肌鈣化相關(guān)[11]。NO是內(nèi)皮細胞分泌的舒張血管物質(zhì)，NO活性降低不僅損傷血管內(nèi)皮，而且激活相關(guān)炎癥因子，加重血管病變，MTHFR基因TT型NO水平下降與CC/TT型有顯著差異[12]，進一步推測MTHFR基因C677T突變通過內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、激活部分凝血因子、降低NO水平等途徑導(dǎo)致血栓形成，但均與其突變導(dǎo)致的高Hcy密切相關(guān)。邱玲等[13]發(fā)現(xiàn)MTHFR基因C667T多態(tài)性與DVT形成無關(guān)，但Hcy水平提高是DVT發(fā)病的獨立危險因子。Morelli等[14]研究亦顯示MTHFR基因C677T多態(tài)性TT型并未增加患DVT風(fēng)險。各家報道結(jié)論不一可能與該基因突變存在種族與地域性差異相關(guān)。

血瘀證是多種疾病如冠心病、高血壓、腦梗死、栓塞證等的共有證候，是一個具有共同特性的基礎(chǔ)證，具有整體性、概括性及預(yù)測性，是證候本質(zhì)研究的一個最具代表性證候。從腎為先天之本，主液，主納氣，為氣之根，氣能行血等方面，可知血瘀易感性與先天遺傳因素存在一定聯(lián)系。中醫(yī)較早認識到體質(zhì)的差異性與疾病的易感性及個體對藥物治療反應(yīng)的多樣性相關(guān)，同一種疾病常表現(xiàn)出不同的證候，而不同疾病可有相同證候，可見同一種疾病的不同證候除了基因表達的差異外，可能存在多種基因的多態(tài)性，同一證候亦可能存在多種基因的多態(tài)性，提示證候是由多種基因共同參與調(diào)控的，且處于人體正常網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)能力之上的“絡(luò)病”證候群。這些證候群之間的維系是通過由各自癥狀的相關(guān)表達基因構(gòu)成的一個調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)，調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中各個基因作用不同，這種差別既是區(qū)別其他證候的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是認同其所代表的典型表現(xiàn)在證候中的關(guān)鍵性與貢獻度的證據(jù)[15]。中醫(yī)證候作為中醫(yī)藥理論基石，是中醫(yī)藥理論的特色與優(yōu)勢所在，大力發(fā)展中醫(yī)證候研究將是中醫(yī)藥現(xiàn)代化與國際化的切入點，血瘀證為代表性證候。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)、基因組學(xué)的不斷研究，為客觀地實施臨床證候表型(分型)研究提供有利條件，有效推動中醫(yī)基礎(chǔ)理論與臨床診療的發(fā)展。本研究從遺傳學(xué)領(lǐng)域的基因多態(tài)性入手，初探MTHFR基因多態(tài)性與血瘀證的相關(guān)性，提示MTHFR基因突變CT/TT型可能是DVT血瘀證的易感因素之一，同時提示高Hcy可能與血瘀證形成相關(guān)，能否作為血瘀證的一個診斷指標有待進一步研究。

綜上所述，治療DVT以改善病人生活質(zhì)量，降低致殘率、死亡率為最終目的。近年來MTHFR基因多態(tài)性研究較多，尤其是MTHFR C677T多態(tài)性，其與多種疾病均存在相關(guān)性，可能與遺傳、人種及地域相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)攜帶MTHFR基因677 CT/TT基因型及高Hcy是DVT形成的危險因素。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下，運用精準醫(yī)學(xué)技術(shù)和方法，結(jié)合中醫(yī)望、聞、問、切四診所得信息，實現(xiàn)精準的中醫(yī)辨證分類及診療，是中醫(yī)藥發(fā)展的方向。本研究結(jié)果顯示MTHFR基因677 CT/TT基因型可能是DVT血瘀證形成的易感因素之一，為基因多態(tài)性與中醫(yī)血瘀證的相關(guān)性提供了客觀依據(jù)。