腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133及LGR5在胃腺癌中的表達(dá)及意義

黎美仁，王麗麗，徐 曉

(1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科;2.九江市婦幼保健院急診科，江西 九江 332000)

胃腺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率雙高的惡性腫瘤，如何提高患者的生存期及生活質(zhì)量是個(gè)長(zhǎng)期值得關(guān)注的問(wèn)題?，F(xiàn)今，靶向治療發(fā)展迅猛，CD133及LGR5作為胃癌干細(xì)胞潛在標(biāo)記物，能否作為新的靶點(diǎn)讓更多特別是晚期或不能耐受手術(shù)患者受益值得探討。因此，本研究擬通過(guò)建立胃癌組織芯片，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)胃癌中LGR5與CD133蛋白的表達(dá)情況，分析二者的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，有利于指導(dǎo)胃癌患者的治療方案的選擇和預(yù)后的評(píng)估，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料收集2013～2015年九江學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院/附屬醫(yī)院病理科手術(shù)切除胃腺癌組織標(biāo)本120例。標(biāo)本類型包括：胃全切及胃部分切除標(biāo)本。其中男86例，女34例；年齡33～81歲，中位年齡62歲，年齡>60歲者72例，年齡≤60歲者48例；腫瘤直徑>5 cm者22例，腫瘤直徑≤5 cm者98例，根據(jù)胃癌Lauren分型，彌漫型46例(圖1)，腸型74例(圖2)；按是否存在脈管瘤栓：44例存在，76例不存在；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，其中73例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，47例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；臨床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期41例，Ⅲ期44例，Ⅳ8例。取距離腫瘤大于5 cm處胃黏膜作為對(duì)照組織，每例標(biāo)本的病理組織學(xué)診斷都經(jīng)過(guò)兩位有經(jīng)驗(yàn)的高年資病理醫(yī)師重新復(fù)片、審核。

1.2試劑濃縮型兔抗人CD133抗體、濃縮型兔抗人LGR5抗體(均為工作濃度1∶200，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)； MaxVision試劑盒及DAB顯色試劑均購(gòu)自福州邁新生物公司。

圖1彌漫型胃腺癌(HE×40)

圖2腸型胃腺癌(HE×40)

1.3方法所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm切片，于二甲苯及梯度乙醇溶液中脫蠟水洗。免疫組化采用MaxVision法，應(yīng)用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4結(jié)果判定免疫組化結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片做出判斷。結(jié)果判讀，陽(yáng)性定位于細(xì)胞膜，用半定量的方法對(duì)切片免疫組織化學(xué)法的染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%為0 分，5%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，>76%為4分。最終評(píng)分=染色程度×陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：0分為陰性，小于6分為弱陽(yáng)性，大于等于6分為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.9軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，CD133與LGR5在各組間樣本率的比較采用卡方檢驗(yàn)，CD133與LGR5在胃腺癌組織表達(dá)之間的相關(guān)性采用 Spearman 等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD133和LGR5蛋白在胃腺癌及癌旁組織中的表達(dá)120例胃腺癌患者中，CD133蛋白陽(yáng)性率36.7%(44/120)，其中強(qiáng)陽(yáng)性29例(圖3)，弱陽(yáng)性15例(圖4)，癌旁組織中CD133表達(dá)率5%，比較胃腺癌及癌旁組織中CD133的表達(dá)差異，P<0.05(χ2=36.480，P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LGR5 蛋白陽(yáng)性率30.8%(37/120)，其中強(qiáng)陽(yáng)性25例(圖5)，弱陽(yáng)性12例(圖6)，癌旁組織中LGR5表達(dá)率2.5%，二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(χ2=34.680，P=0.000)。

圖3胃腺癌中CD133蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(MaxVision×200)

圖4胃腺癌中CD133蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)(MaxVision×200)

圖5胃腺癌中LGR5蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(MaxVision×200)

圖6胃腺癌中LGR5蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)(MaxVision×200)

2.2CD133和LGR5表達(dá)與胃腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系比較120例胃腺癌患者CD133的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在不同性別、年齡及腫瘤大小之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在不同Lauren分型(χ2=5.711，P=0.017)、有無(wú)脈管瘤栓(χ2=5.319，P=0.021)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=7.880，P=0.005)及不同臨床分期(χ2=9.198，P=0.002)時(shí)，P值均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，LGR5在不同性別、年齡、腫瘤大小及Lauren分型之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而比較有無(wú)脈管瘤栓(χ2=6.964，P=0.008)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.358，P=0.037)及不同臨床分期(χ2=3.925，P=0.048)時(shí)，發(fā)現(xiàn)P均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表1)。

2.3相關(guān)性分析在 120 例胃腺癌組織中，CD133及LGR5陽(yáng)性者21例，二者同時(shí)陰性者60例，CD133陽(yáng)性同時(shí)LGR5陰性者23例，CD133陰性同時(shí)LGR5陽(yáng)性者16例，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果提示，胃腺癌中CD133與 LGR5 表達(dá)存在正相關(guān)(r=0.278,P=0.002)(見(jiàn)表2)。

3 討 論

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是嚴(yán)重威脅人民健康的疾病。在世界范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率排第5位，死亡率排第3位[1]。胃腺癌占所有胃癌的95%，胃癌在發(fā)展中國(guó)家特別是亞洲國(guó)家有很高的發(fā)病率。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，衛(wèi)生條件有了顯著改善，但在中國(guó)，胃癌的發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)仍然居高不下，據(jù)2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，二者人數(shù)分別為67.9萬(wàn)例及49.8萬(wàn)例[2]。 67%～75%的患者開(kāi)始接受抗腫瘤治療時(shí)已處于進(jìn)展期甚至終末期，預(yù)后很差。即使在西方國(guó)家，患者的5年生存率仍只有15%左右[3]。 早期發(fā)現(xiàn)仍然是提高胃癌生存率的最好辦法。目前胃癌研究的主要問(wèn)題是對(duì)胃癌腫瘤細(xì)胞的起源知之甚少，同時(shí)也缺乏可以作為治療靶點(diǎn)的特異腫瘤標(biāo)志。

近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)大部分惡性腫瘤是受腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSC)驅(qū)動(dòng)的。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量的具有自我更新、無(wú)限增殖和多向分化潛能的腫瘤干細(xì)胞，促使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤干細(xì)胞在增殖過(guò)程中，通過(guò)不對(duì)稱分裂,形成一個(gè)新的腫瘤干細(xì)胞和另一個(gè)最終分化為腫瘤細(xì)胞的子細(xì)胞，既產(chǎn)生腫瘤同時(shí)也維持了干細(xì)胞數(shù)目的穩(wěn)定[4]。2006年美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)(AACR)對(duì)于腫瘤干細(xì)胞的定義是:具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限增殖潛能，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起決定性作用，也是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療失敗的根源。目前已從多發(fā)性骨髓瘤、非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中成功分離和鑒定出腫瘤干細(xì)胞，其具有組織特異性標(biāo)志物，如CD34、BMI-1、ABCG2等。

研究表明，Wnt通路的靶基因LGR5 (leucine-rich repeat containing g-protein coupled receptor 5)可能是胃腸道干細(xì)胞的標(biāo)志。LGR5基因位12 q 15，大小為4 208 bp，含有907個(gè)氨基酸開(kāi)放閱讀框架(包括信號(hào)肽21個(gè)、胞外區(qū)540個(gè)、跨膜區(qū)263個(gè)和C末端尾巴83個(gè))，其表達(dá)產(chǎn)物是一種7次跨膜蛋白，隸屬于G蛋白耦聯(lián)受體 (G-protein-coupled receptors, GPCRS)家族的成員。LGR5的配體為R-spondin,兩者結(jié)合能夠增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號(hào)，并對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)起多效作用[5]。有學(xué)者報(bào)道LGR5陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞可以啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生，而已分化的短期生存的LGR5陰性細(xì)胞不能啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生[6]。Barker等研究認(rèn)為，小鼠胃的LGR5陽(yáng)性細(xì)胞分布具有年齡特性，新生小鼠LGR5表達(dá)在位于幽門的基底部及腺體集中區(qū)，而在成年小鼠，LGR5表達(dá)主要局限于成熟幽門腺體基底部，此部位是胃癌的好發(fā)部位之一[7]。LGR5現(xiàn)在被認(rèn)為是胃癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[8]，它還是食道腺癌、胰腺癌、大腸癌及乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志[9-12]。Yamanoi 等[13]通過(guò)RT-PCR 發(fā)現(xiàn)癌組織LGR5 mRNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于非癌的黏膜組織，且與淋巴侵襲相關(guān)。Bu 等[14]在一組257例胃癌患者研究中，分析發(fā)現(xiàn)LGR5+患者的預(yù)后較LGR5-患者差，且LGR5 表達(dá)與腫瘤分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)。本組120例胃腺癌同多數(shù)研究結(jié)果一致，LGR5 蛋白陽(yáng)性率30.8%，LGR5陽(yáng)性胃癌患者臨床分期較高，且更易出現(xiàn)脈管瘤栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

CD133被認(rèn)為是另一腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志，CD133又稱Prominin-1，其是含有5 個(gè)跨膜區(qū)域的單鏈糖蛋白，其N 端位于胞膜外，C 端位于胞膜內(nèi)，并分別在胞膜外形成 2 個(gè)大環(huán)結(jié)構(gòu)和在胞膜內(nèi)形成2 個(gè)小環(huán)結(jié)構(gòu)。Smith 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃腸道腫瘤細(xì)胞上有CD133受體表達(dá)，通過(guò)CD133抗體與其結(jié)合后可使小鼠胃癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)延遲。陸瑞祺等[16]的研究證實(shí)，人胃癌細(xì)胞株中的CD133陽(yáng)性(CD133+)細(xì)胞具有一定增殖分化及耐藥潛能，這些均提示CD133+ 細(xì)胞可能是具有致瘤能力的腫瘤起始細(xì)胞。此外，其還被發(fā)現(xiàn)與直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、腦膠質(zhì)瘤和前列腺癌相關(guān)[17-20]。2010年，Ishigami 等[21]首次檢測(cè)了97 例胃癌患者癌組織中CD133蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CD133的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)28%，該研究還發(fā)現(xiàn)，CD133與胃癌的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，從而認(rèn)為其可能為判斷胃癌預(yù)后的標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)胃腺癌中發(fā)現(xiàn)CD133與脈管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CD133在不同Lauren分型中存在差異，其中彌漫型較腸型更易表達(dá)CD133(χ2=5.711，P=0.017)。Wen 等[22]對(duì)CD133表達(dá)與胃癌患者生存率的關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD133+ 的胃癌患者5 年生存率較CD133-的胃癌患者低。

腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物L(fēng)GR5+及CD133+的胃腺癌，臨床分期高，易于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管瘤栓，這些因素都與預(yù)后密切相關(guān)，而二者表達(dá)與年齡、性別及腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系。通過(guò)分析本組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)胃腺癌中LGR5與CD133的表達(dá)成正相關(guān)，顯示二者在胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程可能存在協(xié)同作用，目前為止，研究二者間關(guān)系的報(bào)道不多，所以其二者間是以何種機(jī)制共同作用尚不明確，有待更多研究來(lái)發(fā)現(xiàn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，CD133與LGR5可作為胃腺癌干細(xì)胞潛在標(biāo)記物，用于評(píng)估胃腺癌的惡性程度及作為新靶點(diǎn)研發(fā)相應(yīng)靶向藥物。