ERβ增加胃癌細(xì)胞氟尿嘧啶化療敏感性的機(jī)制研究

王祥財(cái)，郭 蒸，黃 莉，涂福平，徐雪明，葉建明，賴小強(qiáng)

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江西 贛州 341000)

晚期胃癌化療目前常以5-氟尿嘧啶(5-FU)和鉑類為基礎(chǔ)[1]，延長(zhǎng)部分患者的總生存[2]。以5-FU為基礎(chǔ)的一線化療方案療效不佳[3]，整體有效率不到40%，大部分患者無(wú)法從化療中獲益。如何有針對(duì)性的篩選對(duì)5-FU敏感的胃癌患者對(duì)指導(dǎo)細(xì)胞毒性藥物選擇具有重要意義。

雌激素可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、復(fù)制、發(fā)育、分化等生理過(guò)程，同時(shí)還參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。雌激素受體(ERs)主要包括ERα、ERβ和GPR30，ERα在胃癌組織中表達(dá)低，ERα高表達(dá)提示差的預(yù)后及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移[5]；約40%胃癌組織中ERβ過(guò)表達(dá)[6]，高表達(dá)者淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移率較低，提示較好的預(yù)后，但與胃癌臨床病理(如年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤的分級(jí))無(wú)關(guān)[7-8]。另外，有研究顯示ER陰性的乳腺癌患者行新輔助化療的有效率較ER陽(yáng)性的患者高，化療前后部分患者ER表達(dá)水平發(fā)生變化[9-11]；ERβ1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)可影響靶向藥物敏感性[12]。因此，ER的表達(dá)與腫瘤化療具有相關(guān)性，可作為預(yù)測(cè)療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而胃癌中ERs的表達(dá)水平對(duì)5-FU藥物敏感性的影響尚不清楚，本研究探索ERs主要是ERβ的表達(dá)與5-FU化療療效的相關(guān)性及可能的機(jī)制，為臨床化療方案選擇及優(yōu)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系與材料胃癌細(xì)胞AGS和KatoⅢ來(lái)源ATCC?？笶Rα單抗(#ab32063)、抗ERβ單抗(#ab3577)購(gòu)自Abcam公司；GST-ERβ質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司(#35563)；ERβ-siRNA、抗Cyclin E單抗(sc-481)、抗Cyclin D1單抗(sc-4074)購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；抗TP單抗(MA5-13542)購(gòu)自ThermoFisher公司。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、WST-1試劑盒(MK400)購(gòu)自Takara公司。SYBR green標(biāo)記預(yù)混液購(gòu)自Applied Biosystem公司。

1.2免疫組化本院臨床胃癌患者的手術(shù)標(biāo)本，常規(guī)固定切片，常規(guī)免疫組化步驟，一抗為抗ERα、ERβ抗體，顯微鏡觀察腫瘤及癌旁組織中ERα及ERβ的分布情況。

1.3免疫印跡培養(yǎng)細(xì)胞或轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后提取全細(xì)胞蛋白裂解液。取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜。一抗稀釋比例按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PBS沖洗后采用對(duì)應(yīng)二抗孵育。ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的蛋白。

1.4RT-PCR常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA。根據(jù)ERβ的DNA序列設(shè)計(jì)引物并比對(duì)驗(yàn)證，上游5′-aagaagattcccggctttct-3′，下游5′-tctacgcatttcccctcatc-3′；GAPDH為內(nèi)參。取0.5 μg cDNA檢測(cè)目的基因，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5WST-1增殖實(shí)驗(yàn)常規(guī)培養(yǎng)AGS和KatoⅢ細(xì)胞，分別用0 μmol·L-1、0.01 μmol·L-1、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1濃度的5-FU處理AGS和KatoⅢ細(xì)胞24 h，采用WST-1檢測(cè)液處理，選擇450 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GST-ERβ或空白質(zhì)粒(對(duì)照組)，24 h后分別采用10 μmol·L-1的5-FU加入培養(yǎng)板中與細(xì)胞共孵育24 h(生理鹽水為對(duì)照)，WST-1液檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，OD 450表示細(xì)胞增殖速率，相對(duì)細(xì)胞增殖速率=OD 450(實(shí)驗(yàn)組)/OD 450(對(duì)照組)。KatoⅢ細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ERβ-siRNA或空白siRNA(對(duì)照組)，24 h后分別采用10 μmol·L-1的5-FU或者同濃度生理鹽水處理細(xì)胞24 h，WST-1液檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞術(shù)AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GST-ERβ或空白質(zhì)粒，48 h后收集細(xì)胞，PBS沖洗，70%乙醇固定細(xì)胞過(guò)夜，PI染色后采用細(xì)胞流式方法確定兩組中AGS細(xì)胞處于G0、G1、S、G2期的細(xì)胞比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1ERβ在胃癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)女性胃癌患者(經(jīng)胃鏡明確診斷)，排除禁忌后行手術(shù)治療，術(shù)后分期T4N3M0，石蠟標(biāo)本行免疫組化結(jié)果顯示，ERα在胃癌組織及癌旁正常組織中均未見(jiàn)明顯表達(dá)；ERβ在胃癌組織的表達(dá)高于癌旁正常組織(圖1)，與前人報(bào)道一致[12]，故后續(xù)我們僅觀察ERβ在胃癌中的表達(dá)及作用。常規(guī)培養(yǎng)人腸上皮細(xì)胞HIEC、胃癌細(xì)胞KatoⅢ和AGS，分別提取mRNA和總蛋白行qPCR和免疫印跡檢測(cè)ERβ表達(dá)，胃癌細(xì)胞KatoⅢ和AGS中ERβ的表達(dá)較正常腸上皮高，其中以KatoⅢ細(xì)胞ERβ表達(dá)最高(圖2，P<0.05)。

圖1 ERα蛋白(A)和ERβ蛋白(B)在胃癌及癌旁組織中的分布

2.2ERβ增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU的化療敏感性常規(guī)培養(yǎng)AGS和KatoⅢ細(xì)胞，分別用0 μmol·L-1、0.01 μmol·L-1、0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1濃度的5-FU處理AGS和KatoⅢ細(xì)胞24 h，WST-1增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5-FU抑制AGS和KatoⅢ細(xì)胞增殖(處理組分別與對(duì)照組比較P<0.05)，并呈濃度依賴性，其中5-FU對(duì)KatoⅢ細(xì)胞增殖的抑制作用強(qiáng)于對(duì)AGS細(xì)胞(圖3，P<0.05)。AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GST-ERβ或空白質(zhì)粒，常規(guī)培養(yǎng)48 h，免疫印跡鑒定轉(zhuǎn)染成功；同時(shí)采用10 μmol·L-1的5-FU處理細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)5-FU抑制AGS細(xì)胞增殖，其中以GST-ERβ組細(xì)胞增殖的抑制最為明顯(圖4，P<0.05)。KatoⅢ細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染ERβ-siRNA和空白siRNA，常規(guī)培養(yǎng)48 h時(shí)，免疫印跡鑒定轉(zhuǎn)染成功；同時(shí)采用10 μmol·L-1的5-FU處理細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)5-FU抑制KatoⅢ細(xì)胞增殖，其中ERβ-siRNA組細(xì)胞增殖的抑制作用較對(duì)照組減弱(圖5，P<0.05)。

*和**分別代表AGS和KatoⅢ中實(shí)驗(yàn)組(5-FU

5-FU處理組與對(duì)照組比較，*P<0.05；ERβ過(guò)表達(dá)

5-FU處理組與對(duì)照組比較，*P<0.05；ERβ干擾

2.3ERβ誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G1期阻滯AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GST-ERβ和空白質(zhì)粒(對(duì)照組)，24 h后提取兩組細(xì)胞總蛋白，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞提高ERβ蛋白的表達(dá)可抑制周期蛋白D1、E表達(dá)(圖6)；24 h后取相同細(xì)胞，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞提高ERβ蛋白的表達(dá)可減少AGS中G2期細(xì)胞百分比，可增加AGS中G1期細(xì)胞百分比(圖7)。

圖6 ERβ過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白D1、E的表達(dá)

圖7 ERβ過(guò)表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞周期的影響

2.4ERβ通過(guò)誘導(dǎo)TP表達(dá)增加5-FU化療敏感性AGS細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染GST-ERβ和空白質(zhì)粒(對(duì)照組)，24 h后提取2組細(xì)胞總蛋白，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AGS細(xì)胞提高ERβ蛋白的表達(dá)可促進(jìn)TP蛋白表達(dá)(圖8)。AGS細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染相應(yīng)的質(zhì)粒或siRNA，免疫印跡證實(shí)轉(zhuǎn)染成功；同時(shí)采用10 μmol·L-1的5-FU處理細(xì)胞24 h可抑制AGS增殖，過(guò)表達(dá)ERβ增加AGS對(duì)5-FU的化療敏感性，抑制TP部分抵抗ERβ誘導(dǎo)的化療敏感性(圖9，P<0.05)。

圖8 ERβ過(guò)表達(dá)促進(jìn)TP生成

在5-FU處理下，ERβ過(guò)表達(dá)聯(lián)合TP干擾組

3 討 論

本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)1例胃癌組織中ERs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該患者癌組織及癌旁正常組織ERα的表達(dá)均不顯著，ERβ在胃癌組織中的表達(dá)高于正常組織，這一現(xiàn)象與前期相關(guān)報(bào)道的結(jié)果相符[6]；基于上述結(jié)果，僅ERβ表達(dá)有差異，進(jìn)一步行免疫印跡檢測(cè)胃癌細(xì)胞及正常腸上皮細(xì)胞中ERβ的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞中ERβ水平較正常腸上皮細(xì)胞高。然而ERβ的表達(dá)在胃癌中的作用及機(jī)制尚不明確。我們進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)觀察了ERβ表達(dá)水平對(duì)5-FU化療敏感性的影響。增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和KatoⅢ的增殖作用呈濃度依賴，ERβ表達(dá)較高的KatoⅢ細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性高于ERβ表達(dá)較低的AGS細(xì)胞；在AGS細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ERβ可提高其對(duì)5-FU化療的敏感性，在KatoⅢ細(xì)胞中抑制ERβ的表達(dá)可降低其對(duì)5-FU的化療敏感性。上述結(jié)果提示，ERβ在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平可影響5-FU對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，ERβ過(guò)表達(dá)增加5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞的化療敏感性，ERβ敲低表達(dá)降低5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。

有研究發(fā)現(xiàn)ERβ可通過(guò)抑制myc基因、周期蛋白D1、A 表達(dá)和激活P21、P27的表達(dá)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞阻滯于G2期，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖及擴(kuò)散[13-14]。本研究通過(guò)免疫印跡發(fā)現(xiàn)，上調(diào)胃癌細(xì)胞AGS中ERβ蛋白可抑制細(xì)胞周期蛋白D1、E的表達(dá)，其中抑制周期蛋白D1表達(dá)，可抑制E2F1基因(E2F1基因是G1/S期關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而致使大量胃癌細(xì)胞阻滯于G1期[15]；抑制周期蛋白E表達(dá)同樣也致使大量胃癌細(xì)胞阻滯于G1期[16-17]。另外，流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)胃癌細(xì)胞AGS中ERβ蛋白可減少處于G0期的胃癌細(xì)胞，增加處于活化的胃癌細(xì)胞。并且在增加處于活化的胃癌細(xì)胞的基礎(chǔ)上，S期無(wú)明顯差異而G2期細(xì)胞明顯較少，明顯增加了處于G1期的胃癌細(xì)胞。概括而言，ERβ可減少處于G0期的胃癌細(xì)胞，增加處于G1期的胃癌細(xì)胞，即ERβ可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞G1/G0期阻滯，使化療耐藥細(xì)胞數(shù)(G0期)明顯減少，從而增加5-FU的敏感性。

另外，氟尿嘧啶類藥物在體內(nèi)主要通過(guò)胸苷磷酸化酶TP活化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸后抑制胸苷酸合成酶TS，從而抑制尿嘧啶脫氧核苷轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏っ撗鹾塑眨蓴_S期DNA的生物合成，致使大量胃癌細(xì)胞處于S期，從而抑制細(xì)胞有絲分裂，減少細(xì)胞增殖[18-19]。免疫印跡發(fā)現(xiàn)上調(diào)胃癌細(xì)胞AGS中ERβ蛋白可促進(jìn)TP蛋白表達(dá)；增殖實(shí)驗(yàn)表明，siRNA抑制TP后可部分阻斷ERβ誘導(dǎo)的氟尿嘧啶化療敏感性。ERβ在胃癌細(xì)胞中可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞TP表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)5-FU活化為氟尿嘧啶脫氧核苷酸，增加5-FU化療敏感性。

綜上所述，本研究通過(guò)臨床標(biāo)本及細(xì)胞株觀察了ERβ在胃癌中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ERβ可通過(guò)誘導(dǎo)G1/G0期阻滯和TP表達(dá)，從而增加5-FU對(duì)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。上述研究結(jié)果提示ERβ有望作為5-FU在胃癌中臨床療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)，從而作為預(yù)測(cè)指標(biāo)指導(dǎo)用藥，但仍需行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。