基于生物信息學(xué)分析和預(yù)測人骨肉瘤中Gab2靶向作用的miRNA分子

張 蕊，吳啟洋，劉紀明，郭曉儀，吳龍火

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院制藥工程教研室；2.2017級制藥工程專業(yè)本科；3.2016級制藥工程專業(yè)本科，江西 贛州 341000)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性骨腫瘤，是兒童和青少年中第三大常見癌癥，僅次于淋巴瘤和腦癌[1]。它是間充質(zhì)來源的腫瘤，是一種惡性腫瘤，主要影響長骨但還可以累及身體其他骨骼。80%以上的骨肉瘤患者在診斷時有轉(zhuǎn)移性或微轉(zhuǎn)移性疾病，除手術(shù)外，幾乎所有患者都要接受多藥物化療[2]。手術(shù)治療的發(fā)展已經(jīng)顯著減少了切除肢體的風(fēng)險，已成為主要的治療方法。隨著時間的推移，患者的預(yù)后也有所改善，由于治療方法和化療的進步，生存率從低于30%上升到超過70%[3]。盡管取得了這些進展，但針對骨肉瘤的新的靶向藥物和生物標記物仍有很大的研究空間，需要不斷完善[4]。

Grb2相關(guān)結(jié)合蛋白2(Grb2-associated binding protein2，Gab2)是體內(nèi)一類支架蛋白，是生長因子受體結(jié)合蛋白2 ( Growth factor receptor-bound protein 2, Grb2)的相關(guān)結(jié)合蛋白家族(Grb2-associated binder protein, Gab)。在人類當中Gab家族有4個分子，它們的生物學(xué)功能十分復(fù)雜[5]。Gab2是這個家族中的重要的組成成員，它是酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)激活的下游信號通路中的關(guān)鍵分子[6]，參與了細胞內(nèi)多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，其含有pleckstrin同源(PH)結(jié)構(gòu)域，并且可以結(jié)合SHP2酪氨酸磷酸酶和Grb2銜接蛋白，通過充當細胞因子和生長因子受體以及T細胞和B細胞抗原受體響應(yīng)刺激的適配器而傳遞各種信號[7]。在許多腫瘤中，Gab2蛋白的表達水平明顯增高，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。在臨床上，Gab2也可以作為許多腫瘤的分子標記物[9-11]。近年來研究證明Gab2蛋白與細胞的多種生物學(xué)進程相關(guān)，如腫瘤細胞生長和血管生成[12]、腫瘤細胞增殖[13]、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]，并且Gab2蛋白也參與了細胞的分化[15]等過程。在人骨肉瘤中Gab2也有著關(guān)鍵的作用，周學(xué)軍等人研究發(fā)現(xiàn)，在29例骨肉瘤組織中Gab2的mRNA含量和蛋白含量均顯著高于骨樣骨瘤組織，骨肉瘤組織中TAp73、Beclin1、Caspase-1的mRNA含量和蛋白含量均顯著低于骨樣骨瘤組織且與Gab2的mRNA含量和蛋白含量呈負相關(guān)，STMN1、Survivin的mRNA含量和蛋白含量均顯著高于骨樣骨瘤組織且與Gab2的mRNA含量和蛋白含量呈正相關(guān)，說明骨肉瘤組織中高表達的Gab2能夠抑制原癌基因的表達、增加促增殖和遷移基因的表達，進而促進骨肉瘤組織中細胞的生長、遷移[16]。平勇等也證明了Gab2在人骨肉瘤U2-OS細胞系中高表達，并且通過siRNA抑制Gab2后對人骨肉瘤U2-OS細胞的遷移和侵襲能力有明顯的抑制作用[17]。

MicroRNAs(miRNAs)是一類長度約為18～24個堿基的單鏈小分子RNA，具有多種不同的生物學(xué)功能和病理學(xué)意義。它是由雙鏈的pre-miRNA經(jīng)過Dicer酶加工后生成，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達[18]。近年來很多研究表明，miRNAs在腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡中起到了十分重要的調(diào)控作用[19-21]。與正常乳腺細胞相比，低轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞中miR-125b表達明顯更低，而在高轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞中，其表達量增加。進一步研究證明miRNA-125b可以通過靶向作用于STARD13而誘導(dǎo)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[22]；在膀胱癌細胞中，miR-22表達下調(diào)，并且通過靶向結(jié)合MAPK1、Snail 抑制細胞的轉(zhuǎn)移，促進細胞凋亡[23]。各研究表明miRNAs具有多靶點、組織特異性和高效性的調(diào)控特點。而在人骨肉瘤中，表達異常的miRNA也有很多，如與正常的骨組織相比，miR-543的表達明顯上調(diào)，并且miR-534能夠促進人骨肉瘤細胞的生長[24]；因此，以miRNAs作為切入點，有可能為治療骨肉瘤提供一種新的、多層次、多途徑的腫瘤治療策略[18]。

每一個miRNA具有多個作用靶點，而每一個蛋白的mRNA又能結(jié)合多個miRNAs，miRNA-靶基因的作用機制復(fù)雜，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分龐大，在各種疾病的發(fā)生進程中起著十分重要的作用。目前關(guān)于Gab2在人骨肉瘤中的研究很少，雖然已經(jīng)證明在人骨肉瘤中，Gab2表達上調(diào)，并且下調(diào)Gab2的表達可以抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但是對于Gab2的調(diào)控機制并沒有具體地闡述[25]。本研究通過生物信息學(xué)分析方法，預(yù)測和評價了人骨肉瘤中可能與Gab2結(jié)合的miRNA分子，為進一步研究人骨肉瘤中Gab2的調(diào)控作用機制提供理論基礎(chǔ)，并為臨床研究人骨肉瘤靶向治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料實驗需要的硬件是一臺電子計算機，需要的軟件及在線程序見表1。

表1 預(yù)測與Gab2靶向結(jié)合的miRNAs所使用的在線程序及網(wǎng)站

1.2實驗方法

1.2.1MiRWalk2.0預(yù)測與Gab2靶向結(jié)合的miRNAsMiRWalk 2.0是一個綜合性數(shù)據(jù)庫，提供來自人類、小鼠、大鼠以及狗等物種的miRNA的預(yù)測信息和經(jīng)過驗證的位于其靶基因上的結(jié)位點。MiRWalk 2.0整合了多種不同算法對預(yù)測數(shù)據(jù)的處理，以期得到靶蛋白-miRNAs可能的結(jié)合位點。MiRWalk 2.0有12個在線生物信息學(xué)軟件，如targetScan、miRDB、miRTarBase、MicroT4等，也就是說，它可以通過對這12個軟件的預(yù)測結(jié)果進行分析整合并取“交集”，從而得到能夠與Gab2靶向結(jié)合的miRNAs。

1.2.2MiRanda軟件對預(yù)測得到的與Gab2結(jié)合的miRNAs進行結(jié)合穩(wěn)定性和特異性的分析MiRanda數(shù)據(jù)庫提供了關(guān)于人類、果蠅和斑馬魚等物種基因組的miRNA靶目標的預(yù)測信息以及miRNAs在不同組織中的表達譜。將Gab2輸入miRanda在線程序的“Target mRNA search”框中，可以得到Gab2和與之靶向結(jié)合的miRNA的mirSVR score和PhastCons score，用以判斷Gab2和miRNAs結(jié)合的特異性和穩(wěn)定性。

1.2.3miRNA表達譜數(shù)據(jù)的獲得及差異miRNA分析從Gene Expression Omnibus (GEO)數(shù)據(jù)庫中下載miRNA芯片數(shù)據(jù)GSE70367，GSE70367包括1個正常的人間充質(zhì)干細胞株，5個人骨肉瘤細胞株。數(shù)據(jù)預(yù)處理后，使用GEO自帶的GEO2R軟件分析miRNA芯片數(shù)據(jù)。對骨肉瘤組和正常組的差異表達miRNA進行篩選，篩選閾值為P<0.05，log|FC|>1。

2 結(jié) 果

2.1MiRWalk2.0對Gab2靶向結(jié)合的miRNAs預(yù)測MiRWalk 2.0中，12個在線預(yù)測軟件有8個軟件預(yù)測到22個miRNAs可能與Gab2相結(jié)合，結(jié)果如表2所示。將獲得的22個miRNA分子與Gab2的結(jié)合情況進行下一步的分析，預(yù)測和尋找結(jié)合特異性及穩(wěn)定性較好的miRNAs。

表2 MiRWalk 2.0 在線軟件預(yù)測與Gab2靶向結(jié)合的miRNAs

2.2Gab2與預(yù)測得到的miRNAs結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性評分利用miRanda軟件對miRNA-Gab2進行熱力學(xué)穩(wěn)定性評分和序列保守性評分。MirSVR score是蛋白與miRNAs結(jié)合的熱力學(xué)評分，該評分越低表明蛋白和miRNAs靶向結(jié)合的概率越大，在miRanda軟件中這個評分是判斷靶向關(guān)系的十分重要依據(jù)。結(jié)果如表3所示，通過結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-1236-3p和miR-218-5p與Gab2結(jié)合的熱力學(xué)穩(wěn)定性評分分別位于第一位和第二位，說明它們的結(jié)合穩(wěn)定性和特異性均較高。PhastCons score是序列保守性評分，表示的是基因非翻譯區(qū)在不同物種中的進化保守性強弱，該評分越高則表明序列保守性越強，蛋白和miRNAs靶向結(jié)合的概率越大。與Gab2結(jié)合的熱力學(xué)穩(wěn)定性評分較高的miR-1236-3p和miR-218-5p，它們的序列保守性評分也比較高，分別位于第二位和第六位，說明在不同物種間的序列保守性相對較高，結(jié)果如表3所示。這兩個結(jié)果表明，miR-1236-3p和miR-218-5p與Gab2 3'UTR靶向結(jié)合的可能性較高，具有很好的特異性，進一步說明，Gab2可能是miR-1236-3p和miR-218-5p的靶基因。

表3 Gab2-miRNA結(jié)合穩(wěn)定性和特異性評分及miRNA不同物種間的序列保守性評分

2.3骨肉瘤中差異表達的miRNA篩選我們對下載的GSE70367原始數(shù)據(jù)進行處理后用GEO2R對差異表達的miRNA進行分析，其中骨肉瘤組vs對照組得到184個差異表達的miRNA,對于差異miRNA，其中124個miRNA上調(diào)，60個miRNA下調(diào)。在結(jié)果中選取表達下調(diào)和上調(diào)程度最大的前20個miRNA，結(jié)果見表4和表5，設(shè)定的閾值為P<0.05，log|FC|>1。在結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)miRWalk和miRanda預(yù)測得到的靶miRNA中miR-218-5p在該芯片中也差異表達，并且表達下調(diào)。

表4 骨肉瘤細胞中表達下調(diào)的miRNA Top20

表5 骨肉瘤細胞中表達上調(diào)的miRNA Top20

3 討 論

骨肉瘤是由骨質(zhì)的產(chǎn)生來界定的，在所有兒童病發(fā)的癌癥中骨肉瘤占3%～6%，占成人的1%[26]。它的發(fā)病機制并不是很清楚，誘發(fā)骨肉瘤的原因有包括放射或化療史，有Paget的疾病史或其他良性骨病變和遺傳病，包括遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤，Li-Fraumeni綜合征，Rothmund-Thomson綜合征和Bloom Werner綜合癥[27]。存活率較差是為什么骨肉瘤為目前癌癥誘發(fā)死亡的第二大原因。而與骨肉瘤相關(guān)的miRNA的發(fā)現(xiàn)為更好的地了解和解決這種侵襲性骨癌提供了生物學(xué)的分子基礎(chǔ)[28]。在骨肉瘤中miR-513a-5p下調(diào)表達，同時APE1的過表達。有趣的是，當APE1被敲除時，miR-513a-5p的水平更高;因此，在骨肉瘤中miR-513a-5p與APE1表達之間存在反比關(guān)系。 此外，恢復(fù)miR-513a-5p的水平可以使細胞對電離輻射敏感。這對APE1產(chǎn)生負面影響，并且該基因的表達降低可增強放射敏感性誘導(dǎo)后續(xù)凋亡[29]。而miR-21,miR-224及miR-138也證明參與了骨肉瘤的化療[30-32]。由此可見，miRNA在骨肉瘤中發(fā)揮著重要的作用，尋找骨肉瘤中差異表達的miRNA對該疾病治療有重要意義。

Gab2是一類缺乏酶活性的支架蛋白，雖然它沒有酶活性，但是可以通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用來調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的許多效應(yīng)分子，如生長因子受體、細胞因子受體以及整合素等，使這些受體與包含Src同源性結(jié)構(gòu)域2(SH2)的效應(yīng)器相結(jié)合[33]。當配體刺激受體后，活化的受體發(fā)生自身磷酸化并且提供磷酸化的酪氨酸位點用于招募Grb2[34]。Gab2能與Grb2結(jié)合，并且在多個酪氨酸位點被磷酸化，從而與SHP2、p85的SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這種相互作用誘導(dǎo)構(gòu)象發(fā)生變化，解除了SHP2催化位點的自動抑制，并且減少了p85對PI3K中P110催化亞基的抑制作用[35]。Xinran Li等報道，在卵巢癌中敲除PIK3R1后，卵巢癌細胞表現(xiàn)出一系列致瘤性的表型。PIK3R1的缺失將通過誘導(dǎo)磷酸化蛋白質(zhì)Gab2激活A(yù)KT和p110非依賴性JAK2/STAT3信號通路，因此，Gab2可以降低AKT的抑制作用，同時能夠促進JAK2/STAT3信號[36]。YU等人發(fā)現(xiàn)miR-486-5p在非小細胞肺癌中表達下調(diào)而Gab2上調(diào)，進一步實驗證實miR-486-5p可以通過抑制Gab2而抑制細胞的增殖和侵襲[37]。雖然有實驗證明在骨肉瘤中Gab2表達上調(diào)，并且與癌癥的發(fā)生轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但有關(guān)其機制研究幾乎是空白。

miRNAs調(diào)節(jié)動物中大多數(shù)基因的表達，經(jīng)典miRNAs的合成是通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生初級miRNAs(pri-miRNAs)，然后這些pri-miRNAs被RNase Ⅲ Drosha切割形成前體miRNAs(pre-miRNAs)，前體miRNAs從核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，它們在那里進一步被RNase Ⅲ Dicer切割成22nt長的雙鏈RNA[38]。其中一條鏈被選擇并加載到Argonaute蛋白上，最終通過結(jié)合靶mRNA抑制基因的表達[38]。靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合靶向miRNA抑制其翻譯和促進降解，mRNA與miRNA的結(jié)合是通過堿基互補配對完成的，有60%以上的編碼蛋白的基因收到miRNAs的調(diào)控[39]。在骨肉瘤中差異表達的miRNA和其他疾病一樣有很多，目前已經(jīng)開發(fā)了許多計算技術(shù)來預(yù)測miRNAs的靶基因并引入多種特征以幫助識別其靶基因，比如miRNA上不同區(qū)域的互補性，結(jié)合位點保守性或靶位點的可及性。與此同時出現(xiàn)了許多在線軟件利用各種算法來預(yù)測miRNAs與靶基因的結(jié)合，這些軟件有Targetscan、Pictar2、PITA、mirbridge、miRMap等。但是不同的預(yù)測算法基于的是不同的miRNA-mRNA結(jié)合特征，單個預(yù)測軟件預(yù)測準確性不高，因此，整合多樣化算法可以改善目標預(yù)測。MiRWalk正是包括幾種不同算法的預(yù)測結(jié)果，以涵蓋所有這些因素，在預(yù)測miRNA靶基因相互作用方面會有更好的準確性，同時，miRWalk數(shù)據(jù)庫提供有關(guān)基因miRNA相互作用的最新信息且免費更新[40]。MiRWalk結(jié)構(gòu)清晰，界面直觀，可方便用戶快速、成功地捕獲數(shù)據(jù)，執(zhí)行統(tǒng)計分析，可視化和下載Gene-miRNA網(wǎng)絡(luò)[41]。

本文正是利用MiRWalk預(yù)測到有22個miRNAs可與Gab2靶向結(jié)合，其中，miR-1236-3p、miR-218-5p與Gab2結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性最好，說明Gab2是miR-1236-3p、miR-218-5p備選靶基因；而利用miRanda軟件對miRNA-Gab2進行熱力學(xué)穩(wěn)定性評分和序列保守性評分發(fā)現(xiàn)，miR-1236-3p、miR-218-5p序列保守性評分也較高，進一步佐證了MiRWalk的預(yù)測結(jié)果?；蛐酒雀咄亢Y選技術(shù)的發(fā)展對各種腫瘤中的表達差異物質(zhì)的檢測大大降低了科研工作者的工作量，本研究中下載了GEO公共數(shù)據(jù)庫儲存的人骨肉瘤的miRNA芯片數(shù)據(jù)GSE70367。使用GEO2R的方法對獲得的數(shù)據(jù)進行篩選，我們發(fā)現(xiàn)來自正常和骨肉瘤細胞株中差異表達的miRNA有184個，其中124個miRNA上調(diào)，60個miRNA下調(diào)。比對miRWalk和miRanda數(shù)據(jù)庫得到靶miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-218-5p在骨肉瘤中差異表達，且表達下調(diào)。因此，miR-218-5p可能是Gab2的靶miRNAs。MiR-218-5p與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如miR-218-5p通過LYN/NF-κB信號通路抑制宮頸癌的生長和轉(zhuǎn)移。MiR-218-5p靶向作用于LHFPL3，在預(yù)防膠質(zhì)瘤細胞的侵襲性中起重要作用。MiR-218-5p在口腔鱗狀細胞癌細胞中表達下調(diào)，并且通過抑制CD44-ROCK通路調(diào)控口腔鱗狀細胞癌細胞的侵襲。

近年來雖然關(guān)于Gab2的研究如火如荼，也有Gab2與miRNAs的很多相關(guān)，但是其在人骨肉瘤中的研究特別少，雖然已經(jīng)證明在人骨肉瘤中，Gab2表達上調(diào)，并且下調(diào)Gab2的表達可以抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但是對于Gab2的調(diào)控機制以及Gab2-miRNAs的關(guān)系并沒有具體地闡述[25]。由此可見，分析與Gab2結(jié)合的miRNAs，研究miRNAs在人骨肉瘤中是如何靶向調(diào)控Gab2具有重要的臨床意義。很多研究已經(jīng)證明Gab2是一個癌基因，通過miRNAs的沉默作用降低Gab2的表達有可能成為治療人骨肉瘤及其他疾病的一種手段， miR-218-5p可以認為是抑癌因子，本研究發(fā)現(xiàn)miR-218-5p與Gab2靶向結(jié)合性很好，但是miRNA-靶基因之間的結(jié)合僅通過預(yù)測準確性并不是一定的，因此還需要通過后續(xù)的實驗來驗證預(yù)測得到的miR-218-5p是否能靶向調(diào)控Gab2。這也是本課題組后續(xù)將要進行研究的內(nèi)容之一。