大鼠卵巢組織體積對其動情周期及體質(zhì)量的影響

程姣姣 阮祥燕，2* 周 琦 李揚璐 杜 娟 金鳳羽 谷牧青 Alfred O. Mueck，2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科，北京 100026；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，北京 100026)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)指的是女性40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，>4個月的停經(jīng)或月經(jīng)不調(diào)，間隔>4周的連續(xù)2次檢測卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)>25 IU/L[1-2]。POI的病因復(fù)雜[3]，50%的患者特發(fā)性病因，即原因不詳[4-5]，但也約20%的患者是醫(yī)源性因素，包括手術(shù)和/或性腺毒性治療，如放射治療(以下簡稱放療)、化學(xué)藥物治療(以下簡稱化療)、造血干細胞移植等[6]。POI患者生育力大大下降，自然妊娠率約5%[7]，POI患者心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、癡呆等發(fā)病率以及各種疾病的早死風(fēng)險增加[1，5]。

卵巢組織凍存移植(ovarian tissue cryopreservation and transplantion，OTCP)[8-10]是一種新興的生育力保護方法，是指在患者性腺毒性治療(放療、化療)之前通過腹腔鏡手術(shù)或者開腹手術(shù)取出部分卵巢組織轉(zhuǎn)移到卵巢組織凍存庫進行處理、冷凍與凍存，待患者性腺毒性治療結(jié)束至少半年、原發(fā)病臨床痊愈后將凍存的卵巢組織復(fù)蘇并移植回患者體內(nèi)[11]。卵巢組織凍存移植是青春期前女性以及放、化療無法延遲女性的唯一生育力保護選擇[12-14]，卵巢組織凍存移植不僅可以保存患者的生育力，也保存了患者的卵巢內(nèi)分泌功能[15-16]。在歐洲等發(fā)達國家，卵巢組織凍存移植技術(shù)已不再是試驗性技術(shù)，可廣泛運用于臨床[17-18]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康的雌性SD大鼠，10周齡，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為20～24 ℃、環(huán)境濕度為50%～70%的SPF級動物房內(nèi)，正常日光周期，自由進食及飲水，保持墊料干燥，每3只一籠。該動物實驗倫理已通過首都醫(yī)科大學(xué)動物部倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審批號：AEEI-2018-163。

1.2 動物的實驗分組和流程

1.3 大鼠不同卵巢體積切除手術(shù)

SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，劑量為40 mg/kg，取俯臥位，剃除其背部兩側(cè)毛發(fā)，依次用碘伏及75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對大鼠背部皮膚進行消毒，無菌條件下分別于其左右側(cè)背部卵巢位置平行于脊柱方向剪開皮膚及肌層，各做一約1.5 cm長度的小口，暴露腹腔，找到卵巢脂肪墊，以鈍頭鑷子夾取卵巢脂肪墊，連同卵巢及部分子宮，取出腹腔，采用眼科剪剪去不同體積的卵巢，將子宮及剩余卵巢連同脂肪墊小心回納入腹腔，分別縫合其肌層及皮膚。

1.4 大鼠動情周期觀察

整個觀察研究期間，每天早上9至10點進行大鼠陰道脫落細胞涂片，固定大鼠，暴露出陰道，用移液槍吸取50 μL 0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液，小心將移液器槍頭插入大鼠陰道0.5～1.0 cm，輕輕吹打3次后吸出，涂片，晾干后備用。在相同的環(huán)境下統(tǒng)一進行陰道細胞涂片染色，染色方法采用瑞氏-姬姆薩染液染色法，在自然干燥的涂片上滴加瑞氏-姬姆薩染液2～3滴覆蓋整個標(biāo)本涂片，染1～2 min后，滴加等量pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液(或等量超純水)，輕輕晃動玻片，與瑞氏-姬姆薩染液充分混勻，染色3～5 min。水洗、吸干、并通過顯微鏡(100×)觀察。鏡下識別出3種類型的細胞：圓形細胞和有核細胞是上皮細胞；沒有細胞核的不規(guī)則細胞是角質(zhì)化細胞；小環(huán)細胞是白細胞，它們的相互比例用于判斷動情周期的不同階段。動情間期陰道細胞以白細胞為主，動情前期陰道細胞以有核細胞為主，動情期陰道細胞以成片的角化上皮細胞為主，動情后期陰道細胞中白細胞、有核細胞、上皮細胞均可見[20]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠動情周期不同時期陰道細胞涂片

陰道細胞涂片的典型圖片見圖1， 圖1A涂片可見大量的白細胞，圖1B涂片可見大量有核上皮細胞，圖1C涂片可見大量成片角化上皮細胞，圖1D可見白細胞、有核上皮細胞以及角化上皮細胞。

2.2 切除不同卵巢組織體積對大鼠動情周期的影響

2.3 切除不同卵巢組織體積對大鼠體質(zhì)量的影響

在卵巢部分切除術(shù)后的4、6、8、10、12周，F(xiàn)組(去勢組)與其他5組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，F(xiàn)組大鼠的體質(zhì)量顯著高于其他5組，A、B、C、D、E組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2，圖3。

圖1 大鼠動情周期不同時期陰道細胞涂片的典型圖片F(xiàn)ig.1 Typical pictures of vaginal cell smears at different periods of estrous cycle in rats (Wright’s-Giemsa staining， 100×)

A: diestrus；B: proestrus；C: estrus；D: metestrus.

表1 各組大鼠動情周期的比較

GroupNumberofcases4Weeks8Weeks12WeeksA124.5±0.774.92±0.665.50±1.05B124.58±0.384.67±0.525.17±0.41C104.42±0.495.67±0.824.67±0.52D124.25±0.504.50±1.006.00±0.00E115.80±0.847.00±2.007.4±0.19F78.50±1.768.67±2.168.67±0.82F17.6678.22712.036P<0.001<0.001<0.001

圖2 不同時間不同組大鼠的動情周期Fig.2 Rat of estrous cycle in different groups at different times

GroupNumberofcaseBaseline4Weeks6Weeks8Weeks10Weeks12WeeksA12251.77±6.32287.47±11.40288.54±17.80295.58±15.16302.73±18.01309.46±19.41B12256.78±6.82284.20±12.31287.15±13.83304.23±16.38295.93±19.46304.55±20.97C10258.95±8.36297.98±15.07284.15±16.93292.95±23.83299.95±23.83297.33±25.68D12250.51±6.32270.20±11.40303.07±12.80315.73±15.16326.94±18.01338.83±19.41E11260.20±7.47304.62±13.48292.78±15.14310.26±17.94320.68±21.31336.66±22.97F7252.60±6.32336.96±11.40356.61±12.80377.59±15.16387.46±18.01402.00±19.41F0.333.9864.2263.9423.3883.590P0.8910.0070.0050.0070.0150.012

圖3 不同時間不同組大鼠的體質(zhì)量Fig.3 Rat of weight in different groups at different times

*P<0.05vsGroup A，Group B，Group C，Group D，Group E.

3 討論

3.1 保留不同卵巢組織體積對動情周期的影響

放射治療聯(lián)合化學(xué)藥物治療(以下簡稱放化療)卵巢組織的損傷以及發(fā)生POI的可能性與放療和/或化療類型、劑量、患者的年齡、本身的卵巢儲備功能都有關(guān)系[21]，卵巢組織凍存患者的年齡一般不超過35歲[12，22]，如果患者的卵巢功能好，可適當(dāng)放寬年齡限制。一旦年輕女性患者確診為癌癥，放化療方案確定后，發(fā)生POI的可能較高時，可考慮增加卵巢組織凍存量[18]，或者如果患者情況允許，可配合其他的生育力保護方案，如卵子凍存、胚胎凍存等[23-24]。截止到2017年7月，全球已有超過132名通過卵巢組織凍存移植技術(shù)誕生的嬰兒[17]，截止到目前，已有超過154名嬰兒，卵巢組織移植后超過95%的患者恢復(fù)了卵巢正常的內(nèi)分泌功能[25-26]，Van der Ven等[27]報道了FertiPROTEKT生殖力保護網(wǎng)絡(luò)更新了最新的匯總數(shù)據(jù)，在卵巢組織凍存時年齡<35歲的女性中，卵巢組織移植后的妊娠率為33%，在超過35歲的女性中，妊娠率為18%[28]。Meirow等[29]報道了卵巢組織移植后妊娠率為53%，活產(chǎn)率為32%。這些充分說明了卵巢組織凍存移植技術(shù)的成熟與可靠，歐洲等發(fā)達國家已將此技術(shù)設(shè)定為臨床常規(guī)[22，30-31]。

3.2 保留不同卵巢組織體積對體質(zhì)量的影響

本研究設(shè)定6個時間點監(jiān)測大鼠的體質(zhì)量，本研究中切除雙側(cè)的卵巢組織大鼠的體質(zhì)量明顯高于其余5組的大鼠。雌性大鼠去勢后將不再分泌雌孕激素，但雌激素對機體脂肪分布和脂肪細胞分化有重要影響，雌激素和雌激素受體調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝的各個方面，雌激素缺乏會使得腹部脂肪堆積，育齡期婦女和更年期婦女的體質(zhì)量和腹部脂肪分布不同，并且絕經(jīng)女性體質(zhì)量增加、超重及肥胖是公共衛(wèi)生問題。40～59歲女性肥胖的發(fā)生率約65%，超過60歲的女性肥胖的發(fā)生率約73.8%[32]，但絕經(jīng)女性肥胖發(fā)生率增加的原因尚不清楚。

3.3 局限性和不足

本研究的設(shè)計存在不足之處，未定期采血檢測SD大鼠血清中卵巢激素濃度或其他指標(biāo)以充分補充或證實本研究結(jié)論。本實驗只觀察了3個月，只能得出觀察的3個月時間內(nèi)每組大鼠動情周期和體質(zhì)量的變化。