白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205次生代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

孫敏 王小姣 丁宇涵 王世梅 李建杰

(1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術(shù)研究重點實驗室，南京 210095；2 英國謝菲爾德大學(xué)，謝菲爾德S3 7HF)

放線菌類群中的鏈霉菌屬(Streptomyces)是一類重要的微生物資源，其次生代謝產(chǎn)物繁復(fù)多變，產(chǎn)生的抗生素在植病生物防治方面具有重要作用[1]。放線菌產(chǎn)生的農(nóng)用抗生素因其易降解、不易使有害生物產(chǎn)生抗藥性等特點已成為無公害農(nóng)藥的主體和未來農(nóng)藥的發(fā)展方向[2]。白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205是本實驗室保存的一株拮抗放線菌，研究發(fā)現(xiàn)該菌株對多種植物病原真菌具有較好的抑制作用，盆栽試驗及田間試驗表明對黃瓜枯萎病及草莓根腐病有很好的防控效果[3-4]。其發(fā)酵上清液的乙酸乙酯萃取液對黃瓜尖孢鐮刀菌及啤酒酵母等具有較強的抑制作用，前期對該活性物質(zhì)的性質(zhì)亦進行了初步研究[5]，為了明確該活性物質(zhì)的成分，通過硅膠制備薄層板對其進行分離純化，并通過1H NMR，13C NMR圖譜、紅外光譜和HPLC-Tof -HRMS鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，本文報道其分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205及啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)實驗室分離保存[4]。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：黃豆粉30.0g，葡萄糖 5.0g，酵母膏5.0g，碳酸鈣5.0g，去離子水1000mL，pH7.5。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20.0g，可溶性淀粉30.0g，蛋白胨2.0g，黃豆粉8.0g，NaCl 2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，CaCO33.0g，K2HPO4·7H2O 0.5g，去離子水1000mL，pH8.0。

1.3 S.albospinus CT205液體發(fā)酵

將S.albospinusCT205在PDA斜面上活化，用接種環(huán)取新鮮的CT205斜面孢子2～3環(huán)接種于滅菌的種子搖瓶培養(yǎng)基中(250mL三角瓶中裝液量50mL)，于28℃搖床，170r/min培養(yǎng)48h，鏡檢菌絲生長旺盛，確認無污染后，以10%接種量接種到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中(1000mL三角瓶中裝液量300mL)，28℃搖床發(fā)酵96h，得S.albospinusCT205的發(fā)酵液。發(fā)酵過程中定時取樣，觀察菌絲體形態(tài)，測定發(fā)酵液pH值變化，并用牛津杯法測定發(fā)酵液粗提物拮抗圈的大小，用以表征活性成分相對含量的變化。拮抗圈大小的測定方法：取發(fā)酵液，6000r/min，4℃，離心15min，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，按50:1的比例獲得濃縮液，取200μL加入牛津杯中，以啤酒酵母為指示菌(每皿涂布100μL 108/mL啤酒酵母細胞)，測定拮抗圈的大小。

1.4 S.albospinus CT205代謝產(chǎn)生活性物質(zhì)的提取及純化

活性物質(zhì)的提取及檢測參照文獻[5]上的方法進行。即將發(fā)酵液離心，取上清液，等體積乙酸乙酯萃取，收集酯相，減壓濃縮，獲得粗提物，用甲醇溶解，用毛細管取少量點樣在GF254硅膠板，進行薄板層析，層析系統(tǒng)為氯仿:乙酸乙酯:甲醇:甲酸(16:1:2:0.04)，展層結(jié)束，在紫外光下觀察各斑點位置，計算其Rf值，并佐以生物自顯影法[6]，確認活性成分的位置。

根據(jù)上述結(jié)果通過制備型硅膠板(10cm×20cm)進行層析分離，割取活性物質(zhì)對應(yīng)條帶，用甲醇浸泡24h，6000r/min，4℃，離心5min，取上清液，減壓濃縮后獲得活性成分，再用GF254薄板檢測斑點是否單一，如斑點不單一，再重復(fù)進行制備型硅膠板層析分離，獲得單體化合物。取少量用甲醇稀釋，以啤酒酵母為指示菌用牛津杯法檢測其抗菌活性。

1.5 活性物質(zhì)紫外(UV)吸收光譜檢測

紫外可見分光光度計(美國Perkin Elmer，Lambda 25)對活性物質(zhì)進行全波長(190～400nm)紫外掃描，以分析純甲醇溶液做參比。

1.6 活性物質(zhì)HPLC-Tof -HR-MS檢測

將割板制備的活性物質(zhì)，先用少量甲醇溶解，然后用甲醇溶液高倍稀釋(×1000)，紙片法檢測抗菌活性仍有較大抑菌圈。將樣品稀釋液過0.22μm的微孔濾膜進行預(yù)處理，再送樣到分析型HPLC(Waters公司)檢測，泵型號1525，紫外檢測器型號2487，色譜柱型號Waters 4.6mm×150mm C18反向柱，進樣量10μL，流動相：甲醇:水=60:40，并根據(jù)樣品極性進行調(diào)整。在此基礎(chǔ)上采用相同流動相，利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜TripleTof?5600+MS系統(tǒng)(AB SCIEX公司，TripleTof?00的升級產(chǎn)品)檢測。HPLC-Tof -HR-MS檢測在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院中心實驗室進行。

1.7 活性物質(zhì)核磁共振(NMR)波譜檢測

1H NMR檢測，稱取樣品及放線酮標準品3～5mg分別溶于0.5mL CD3OD中。13C NMR檢測，稱取樣品及其標準品各30～35mg溶于0.5mL CD3OD中，檢測。采用德國Bruker UltraShiedTM400 Plus核磁共振波譜儀檢測(TMS為內(nèi)標)。

1.8 活性物質(zhì)紅外光譜(FTIR)檢測

采用傅里葉變換紅外光譜分析儀(FTIR)對活性物質(zhì)進行紅外光譜(FTIR)分析。將甲醇溶解的樣品在紅外光譜儀上進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 S.albospinus CT205液體發(fā)酵

S.albospinusCT205在種子搖瓶培養(yǎng)48h后，接種發(fā)酵搖瓶，定期取樣觀察菌絲生長情況，結(jié)果見圖1。在油鏡(10×100)下觀察菌絲形態(tài)變化，CT205在培養(yǎng)24h后菌絲快速生長，48～72h菌絲生長進入對數(shù)期，呈網(wǎng)狀分布，72～96h菌絲生長進入穩(wěn)定期。

發(fā)酵過程中取樣測定發(fā)酵液pH值的變化及發(fā)酵液中活性物質(zhì)抑菌圈的大小，結(jié)果如圖2所示。接種后發(fā)酵起始pH=6.89，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值呈下降趨勢，24h時pH=6.56，較起始階段下降0.33個單位，72h時pH降至6.41，96h后的pH=6.12，較起始降低0.88個單位。發(fā)酵液中活性物質(zhì)的含量，則隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，發(fā)酵48h抑菌圈直徑58.5mm，72h時抑菌圈68.2mm，96h時抑菌圈達到72.7mm。

2.2 活性物質(zhì)的提取及純化

S.albospinusCT205搖瓶發(fā)酵96h后，離心取上清，用乙酸乙酯萃取，離心取酯相，減壓濃縮得濃縮液，用甲醇溶解。選用GF254硅膠板展層，經(jīng)紫外觀察及生物檢測Rf=0.68的組分具有抗菌活性。在制備型硅膠板上多次層析分離，割取有活性的條帶，用甲醇浸泡24h，濃縮回收樣品，TLC純度驗證，最終獲得純化的化合物。

2.3 活性物質(zhì)的紫外吸收光譜

圖1 S.albospinusCT205發(fā)酵過程中菌絲形態(tài)變化(10×100)Fig.1 Change of mycelia morphology during the fermentation of S.albospinus CT205(10×100)

圖2 S.albospinus CT205發(fā)酵液pH及活性物質(zhì)相對含量變化Fig.2 Changes of pH and relative content of active substance in S.albospinus CT205 fermentation broth

前期研究發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)對熱和紫外線均表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性[5]，經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，耐熱、耐紫外輻射且抗真菌的抗生素種類并不多，放線酮(actidione)具有與此相似的特性[7]。將待測活性物質(zhì)與放線酮標準品分別進行紫外掃描，結(jié)果如圖3所示，兩者的紫外吸收光譜相似，最大吸收峰均在λ=215nm處。

圖3 活性物質(zhì)和放線酮的紫外吸光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of active substance and actidione

2.4 活性物質(zhì)的HPLC-Tof -HR-MS檢測

對活性成分進行HPLC-Tof -HR-MS檢測，其一級質(zhì)譜圖(圖4)的質(zhì)荷比(m/z)為282.1701，二級質(zhì)譜圖(圖5)的分子離子峰的m/z為282.1692，離子提取流圖(XIC)(圖6)分析發(fā)現(xiàn)該活性成分在正離子峰模式下的分子離子峰為[M+H]+=282.2，可以確定其分子量為282.2，其與放線酮標準品的分子量(282.2)及一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖一致(限于篇幅放線菌酮標準品二級質(zhì)譜圖未列出)。

圖4 活性物質(zhì)及放線酮一級質(zhì)譜圖Fig.4 Primary mass spectrograms of active substance and actidione

圖5 活性物質(zhì)二級質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrogram of active substance

圖6 離子提取流圖Fig.6 Extracted ion chromatogram

圖7 放線酮結(jié)構(gòu)式Fig.7 Structure of actidione

根據(jù)活性成分二級質(zhì)譜圖，結(jié)合放線酮的結(jié)構(gòu)式(圖7)及其斷鍵的位置可以看出當A、B兩處的化學(xué)鍵同時斷裂時，可以得到鏈狀結(jié)構(gòu)-C(OH)-CH2-C(O)-CH2(CH2)-CH2-CH(CH3)-CH2-和六元環(huán)結(jié)構(gòu)NH(CO)2(CH2)2C-CH2-，并且該斷裂結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的m/z分別為157和119。由此可以得到部分的質(zhì)譜裂解圖：從m/z=282到m/z=265，失去m/z=17的碎片，此碎片為叔碳所連接的羥基結(jié)構(gòu)的分子量，從m/z=282到m/z=157，失去m/z=124的碎片，此碎片為叔碳所連接的羥基及其仲碳連接的羰基的六元環(huán)同時被打碎，所剩下的肽鍵所連接的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)的分子量。根據(jù)分子離子峰(m/z=282.2)：質(zhì)譜圖的主要裂解碎片解釋如圖8所示。從XIC中(圖6)可以看出該活性成分的保留時間(tR=4.953min)與放線酮的保留時間(tR=4.951min)一致，經(jīng)圖譜比對可以確定在tR=4.953min處的化合物成分即是放線酮，又稱環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)其分子式為C15H23NO4。

2.5 活性物質(zhì)的核磁共振波譜

根據(jù)HPLC-Tof -HR-MS的檢測結(jié)果得出該活性物質(zhì)為放線酮，分子式C15H23NO4。根據(jù)已知分子式對該活性物質(zhì)及其放線酮標準品進行NMR波譜檢測。對樣品的1H NMR譜、13C NMR譜結(jié)果進行分析，可以得出：1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δH:4.02(q,J=5.9Hz,1H),3.31(p,J=1.7Hz,1H),2.79～2.51(m,4H),2.42～2.30(m,3H),2.22～2.13(m,1H),2.12～2.01(m,1H),1.98～1.86(m,1H),1.75(td,J=13.2,4.8Hz,1H),1.59(td,J=13.0Hz,4.7Hz,1H),1.50～1.41(m,2H),1.27(d,J=7.1Hz,3H),0.95(d,J=6.4Hz,3H)；13C NMR(100MHz,Methanol-d4)δC:214.8,174.3,174.2,66.2,50.8,42.7,40.3,39.8,38.0,36.5,35.2,27.6,27.0,17.2,13.4。同時將活性物質(zhì)的1H NMR譜、13C NMR譜檢測結(jié)果與放線酮的1H NMR譜、13C NMR譜檢測結(jié)果進行比對，譜圖數(shù)據(jù)相一致，故確認該活性物質(zhì)為放線酮。

2.6 活性物質(zhì)的紅外光譜

圖8 活性物質(zhì)質(zhì)譜離子碎片裂解圖Fig.8 Ion fragmentation diagram of active substance by mass spectrometry

活性物質(zhì)含有不同的結(jié)構(gòu)和原子組成的功能基團，從紅外光譜可以獲得該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，活性物質(zhì)在3000～3600cm-1處具有吸收峰，可以判定該物質(zhì)為有機物，根據(jù)(表1，圖9)物質(zhì)的FTIR特征吸收峰及歸屬，可以看出，該活性物質(zhì)在3297cm-1處有一個-N-H伸縮振動峰，放線酮在3300處有一個同樣的-N-H伸縮振動峰，判定該活性物質(zhì)為存在-NH酰胺類有機化合物。2943cm-1是-N-H的對稱和反對稱伸縮振動吸收峰，2833cm-1是-C-H伸縮振動吸收峰，1451cm-1是-C-H彎曲振動吸收峰，1411cm-1是-C-N伸縮振動吸收峰，1111和1022cm-1是碳水化合物的-C=O的伸縮振動吸收峰，598cm-1是-OH面內(nèi)彎曲振動吸收峰[8-9]。綜上所述，該活性物質(zhì)為含有-NH2、-OH等多種官能團的胺類化合物。同時與放線酮標準品的紅外光譜比對分析得出該活性物質(zhì)與放線酮的紅外光譜在不同頻率下產(chǎn)生的官能團伸縮振動吸收峰的響應(yīng)值的位置范圍(表1)相一致。進而判斷該活性物質(zhì)與放線酮為同一物質(zhì)，即該活性物質(zhì)為環(huán)己酰亞胺，詳情如表1。

表1 活性物質(zhì)FTIR特征吸收峰及歸屬Tab.1 The characteristic absorption peaks and attribution of active substance FTIR

圖9 活性物質(zhì)與放線酮紅外光譜比對Fig.9 Infrared spectra of active substance and actidione

3 討論

S.albospinusCT205代謝所產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)有機溶劑萃取，薄板層析、生物檢測及生物顯影檢測，確定了其Rf值，并用制備型硅膠板分離獲得小批量物質(zhì)。前期研究發(fā)現(xiàn)該活性成分對熱和紫外線均表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性，查閱《抗菌素生物理化特征》[7]，發(fā)現(xiàn)放線酮具有類似特性。將活性成分進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)其在215nm處具有最大吸收峰，吸收光譜圖與放線酮相似。對該活性成分進行了HPLCTof -HR-MS檢測，從一級質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖檢測的結(jié)果確定該物質(zhì)的分子量為282.2，XIC圖顯示在tR=4.953min處有最大吸收峰值。與HPLC-Tof -HRMS檢測的放線酮標準品圖譜比對，發(fā)現(xiàn)待測物質(zhì)與放線酮的一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜及XIC圖譜的結(jié)果一致，確定其分子量和放線酮標準品相同。經(jīng)紅外光譜檢測，碳譜氫譜數(shù)據(jù)分析，得到該物質(zhì)的分子式，功能基團和基本骨架結(jié)構(gòu)，并且通過與放線酮標準品的紅外光譜，1H NMR譜，13C NMR譜圖進行比對分析，佐證了該活性物質(zhì)就是放線酮，其分子式為C15H23NO4，又稱環(huán)己酰亞胺(cycloheximide)。

早在1948年德國化學(xué)家Ford和Leach從灰色鏈霉菌(S.griseus)中分離鑒定出放線酮，發(fā)現(xiàn)其對酵母菌拮抗作用強，對細菌無作用或拮抗作用較小[10]。蔡潤生等[11]研究報道金色鏈霉菌(S.saureus)除代謝產(chǎn)生制霉菌素外，還產(chǎn)生另外一種抗生素—放線酮，具有較強的抗病原真菌能力。放線酮是廣譜抗生素，在防治農(nóng)作物真菌病害上應(yīng)用廣泛，如用于防治煙草黑脛病、煙草赤星病、小麥銹病、茶葉立枯病和玫瑰霉病等[12]。閆貴龍等[13]曾研究用放線酮防控青貯玉米霉變，效果良好，同時放線酮也是鼠類的忌避劑[14]。

放線酮能夠特異性地抑制新蛋白質(zhì)的合成，因此常作為蛋白質(zhì)合成過程的有效抑制劑，應(yīng)用于蛋白的表達、細胞凋亡機制等代謝調(diào)控方面的研究，在醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)上有廣泛的用途[15-18]，如譚曉華等[15]的試驗結(jié)果表明1.0～2.0μg/mL的放線酮能拮抗兒茶素誘導(dǎo)的大腸癌細胞株的凋亡；王小輝[19]報道放線酮可以有選擇性的誘導(dǎo)人原單核白血病細胞系U937細胞凋亡。放線酮雖然是一個古老的抗生素，但仍然有許多新功能有待挖掘。

致謝：感謝南京農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院實驗中心徐江艷老師在HPLC-Tof -HR-MS檢測上給予的幫助。